Edycja genów za pośrednictwem morfolino: technika knockdownu genów wykorzystująca translacyjne blokowanie oligonukleotydów morfolino w jednokomórkowych jajach ryb jaskiniowych

Morfolinos to krótkie, jednoniciowe, przeprojektowane oligonukleotydy różniące się strukturą szkieletu fosforanowego i cukru w porównaniu z naturalnymi nukleotydami. Cechy te zwiększają stabilność morfolinosów przy fizjologicznym pH. Pomimo tych różnic, morfoliny zawierają standardowe zasady nukleotydowe, które pomagają w projektowaniu oligonukleotydów komplementarnych do określonej sekwencji mRNA z pożądanego genu docelowego, który ma zostać powalony.

Aby przeprowadzić edycję genów sterowaną przez morfolinę, zacznij od pobrania jednokomórkowych jaj ryb jaskiniowych umieszczonych w studzienkach płytki iniekcyjnej agarozy. Wizualizuj półprzezroczyste i okrągłe jaja, aby zlokalizować woreczek żółtkowy - wypełnioną płynem strukturę obecną wewnątrz jajka.

Pobrać igłę do mikroiniekcji wstępnie wypełnioną roztworem zawierającym zaprojektowane morfoliny. Wstrzyknąć roztwór bezpośrednio do żółtka jaja, upewniając się, że morfoliny dostaną się do cytoplazmy komórki. Wewnątrz komórek gen docelowy tworzy mRNA, które jest transportowane do cytoplazmy.

W cytoplazmie wstrzyknięta morfolina hybrydyzuje z komplementarnym docelowym transkryptem mRNA w endogennym miejscu inicjacji i rozciąga się poza nie. Proces ten blokuje wiązanie większej podjednostki rybosomu z powstającym kompleksem inicjującym translację składającym się z małej podjednostki rybosomalnej skompleksowanej z pewnymi specyficznymi białkami.

Następnie postęp kompleksu inicjacji translacji jest sterycznie utrudniony, co zatrzymuje translację mRNA do białka. Wreszcie, docelowe stężenie białka zmniejsza się z powodu blokowania translacji przez morfoliny.