Transgeneza danio pręgowanego za pośrednictwem transpozonu Tol2: procedura generowania transgenicznego danio pręgowanego po jednoczesnym wstrzyknięciu systemu Tol2 do zapłodnionych zarodków danio pręgowanego

Zacznij od żywotnych, jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego umieszczonych w studzienkach formy do mikroiniekcji.

Załadować igłę do mikroiniekcji roztworem zawierającym mRNA kodujące transpozazę Tol2 i plazmidy dawcy transpozonów. Plazmidy zawierają wszechobecny promotor danio pręgowanego i gen kodujący białka fluorescencyjne otoczony ramionami transpozonów Tol2.

Ostrożnie wstrzyknąć roztwór do mikroiniekcji do cytoplazmy zarodka danio pręgowanego. W komórce mRNA transpozazy Tol2 przekształcają się w białka transpozazy Tol2 i są aktywnie transportowane do jądra.

Miejsca Tol2 na plazmidzie dawcy zawierają specyficzne odwrócone powtórzenia końcowe lub ITR, flankujące gen reporterowy. ITR-y są otoczone krótkimi, bezpośrednimi powtórzeniami. Białka transpozazy rozpoznają miejsca ITR i wiążą się z nimi, tworząc spinkę do włosów na flankującym DNA. Transpozazy dalej rozszczepiają konstrukt transpozonu od flankującego DNA, uwalniając go z plazmidu i pozostawiając krótkie, bezpośrednie powtórzenia.

Transpozazy tworzą rozłożone w czasie dwuniciowe pęknięcie w genomie komórki somatycznej i wprowadzają konstrukt transpozonu do miejsca genomu. Wypełnienie szczeliny na rozłożonych końcach przez polimerazę DNA, a następnie ligacja nacięć tworzy krótkie, bezpośrednie powtórzenia.

Podwiązanie powoduje integrację stabilnego konstruktu transpozonu z genomem komórki somatycznej, a promotor ułatwia ekspresję białek fluorescencyjnych. Inkubować wstrzyknięte zarodki. Podczas rozwoju embrionalnego komórki somatyczne dają początek różnym typom komórek i tworzą transgenicznego danio pręgowanego.