Edycja genów za pośrednictwem transpozonów PiggyBac w ludzkich iPSC: procedura integracji genu zainteresowania w ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac

Rozpocząć od zawieszenia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, hiPSC, w odpowiednim buforze do elektroporacji. Dodać roztwór składający się z plazmidów kodujących transpozazę PiggyBac i plazmidów dawcy. Elektroporować mieszaninę.

Impulsy elektryczne przejściowo przenikają przez błony komórkowe, ułatwiając komórkowy wychwyt plazmidów. Plazmidy dawcy składają się ze specyficznych dla transpozonów odwróconych powtórzeń końcowych, ITR, które są odwróconymi uzupełnieniami względem siebie, otoczonymi powtórzeniami TTAA nawiasującymi docelowe geny oporności na białko i antybiotyki.

Eksprymowane białka transpozazy PiggyBac tworzą nacięcia na końcach 3' ITR, wewnętrzne dla powtórzeń TTAA. Odsłonięte grupy 3'-hydroksylowe atakują nukleotyd nici komplementarnej wewnątrz flankującego DNA, tworząc spinki do włosów TTAA na końcach transpozonu, uwalniając w ten sposób konstrukt transpozonu z plazmidu.

Transpozazy rozwiązują spinki do włosów, tworząc zwisy TTAA na końcach 5' konstruktu transpozonu. Transpozazy dalej tworzą dwuniciowe pęknięcia w sekwencji TTAA w genomie gospodarza. Uwolnione końce transpozonu 3'-hydroksylowego atakują sekwencję TTAA na rozłożonych końcach, powodując kowalencyjne połączenie konstruktu transpozonu z genomem gospodarza, pozostawiając jednoniciowe luki po bokach konstruktu transpozonu. Te luki w DNA gospodarza są ligowane, co prowadzi do stabilnej integracji konstruktu transpozonu.

Potraktuj hiPSC wysiane na płytce pokrytej białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej pożywką zawierającą antybiotyki. Gen oporności na antybiotyki, napędzany przez promotor przed nim, umożliwia selekcję komórek z edytowanym genem.