Nokaut wielu genów za pośrednictwem CRISPR: technika jednoczesnego nokautowania wielu genów za pomocą niehomologicznego szlaku łączenia końców w komórkach jelitowych myszy

Aby jednocześnie wyeliminować wiele genów za pomocą systemu CRISPR-concatemer-Cas9, zacznij od rurki zawierającej zawiesinę komórek jelitowych myszy. Uzupełnij probówkę wektorami CRISPR-concatemer zawierającymi kasetę ekspresyjną dla wielu przewodników RNA lub gRNA, zintegrowanych obok siebie.

Każda kaseta gRNA jest specjalnie projektowana, aby indywidualnie wyeliminować zamierzony gen. Dodaj wektory ekspresji kodujące endonukleazę Cas9 do tej samej probówki. Elektroportuj mieszaninę komórka-plazmid - technika, która wykorzystuje prąd elektryczny w celu ułatwienia wejścia plazmidów do komórki. Wewnątrz komórki koekspresja konkatelera CRISPR i wektora Cas9 tworzy odpowiednio sekwencje gRNA i nukleazy Cas9.

Każda sekwencja gRNA wiąże się z odpowiednim enzymem Cas9, tworząc wiele kompleksów Cas9-gRNA, które przyłączają się do docelowych miejsc w genomie gospodarza. To wiązanie aktywuje enzym Cas9, który wytwarza nacięcie w obu niciach DNA przed miejscem sąsiadującego z motywem protospacerowym lub PAM. Powoduje to pęknięcie dwuniciowe lub DSB w docelowym DNA.

W przypadku braku jakiejkolwiek sekwencji homologicznej do genu docelowego, uruchamiany jest endogenny mechanizm naprawczy komórki, zwany niehomologicznym łączeniem końców, umożliwiając białkom naprawczym i cząsteczkom kinazy związanie się w miejscu pęknięcia. Później enzym ligazy naprawia DSB, co powoduje modyfikacje docelowej sekwencji genu. Modyfikacje te zaburzają funkcję genów, powodując nokaut wielu genów.