Wyciszanie genów oparte na odwrotnej transfekcji siRNA in vitro: procedura dostarczania małego interferującego RNA do hodowanych komórek w celu inaktywacji ekspresji genu docelowego

Odpipetować siRNA ulepszoną minimalną ilością niezbędnej pożywki do wymieszania i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj odczynnik do transfekcji i ulepszone minimalne niezbędne podłoże do siRNA i odpipetuj do wymieszania. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj mieszankę transfekcyjną do każdego dołka płytki pokrytej kolagenem.

Umyj komórki na 100-milimetrowej szalce Petriego dwukrotnie za pomocą DPBS. Dodaj 5X trypsynę do komórek, upewniając się, że pokryłeś całą powierzchnię trypsyną. Odczekaj 30 sekund i ostrożnie usuń trypsynę. Inkubować szalkę Petriego przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.

Następnie dotknij naczynia, aby odłączyć komórki, unikając ich uszkodzenia. Dodaj 10 mililitrów DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS i 1% penicyliny i streptomycyny, aby zneutralizować trypsynę. Ostrożnie odpipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć komórki i homogenizować zawiesinę komórek.

Policz komórki za pomocą komory liczącej Malasseza lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie komórek do 6,25 x 10⁵ komórek/ml pożywki. Wysiewać 800 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na dołek płytki 12-dołkowej lub 400 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na dołek 24-dołkowej płytki zawierającej mieszaninę transfekcji.

Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych i nie przeszkadzać im przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie zastąp supernatant świeżym DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, a następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora.