Edycja genów za pośrednictwem transpozonów PiggyBac w ludzkich iPSC: procedura integracji genu zainteresowania w ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac

Przepłukać ludzką hodowlę iPSC PBS bez wapnia i magnezu, a następnie potraktować komórki odczynnikiem do dysocjacji komórek przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki zaczną odłączać się od pojemnika hodowlanego, użyj pipety P1000, aby delikatnie ręcznie oddzielić komórki od 3 do 4 razy.

Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i doprowadź końcową objętość do 10 mililitrów świeżym PBS bez wapnia i magnezu w celu policzenia. Zbierz 1 x 10⁶ komórek przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu R z zestawu do elektroporacji.

Dodać 4,5 mikrograma transpozycyjnego wektorowego plazmidowego DNA i 0,5 mikrograma transpozazy plazmidowej DNA transpozazy PiggyBac do transfekcji. Transfekcja z systemem elektroporacji ogniw zgodnie z instrukcją producenta, o wskazanych parametrach. Wtedy. Wysiewaj komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK Y-27632 w 6-milimetrowym naczyniu pokrytym matrycą.