Nokaut wielu genów za pośrednictwem CRISPR: technika jednoczesnego nokautowania wielu genów za pomocą niehomologicznego szlaku łączenia końców w komórkach jelitowych myszy

Rozpocznij tę procedurę od dodania 9 mililitrów zredukowanej pożywki surowicy do 15-mililitrowej probówki zawierającej zawiesinę komórkową i odwiruj w 400G przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć cały supernatant i ponownie zawiesić osad w roztworze do elektroporacji. Dodaj łączną ilość 10 mikrogramów DNA do dwóch nowych probówek. Następnie dodaj roztwór do elektroporacji do końcowej objętości 100 mikrolitrów i trzymaj mieszaninę komórka-DNA na lodzie.

Przenieś mieszaninę komórka-DNA do kuwety do elektroporacji. Umieść kuwetę w komorze elektroporatora. Zmierz impedancję, naciskając odpowiedni przycisk na elektroporatorze i upewnij się, że wynosi od 0,030 do 0,055 oma. Wykonaj elektroporację zgodnie z ustawieniami wskazanymi w protokole tekstowym. Dodaj 400 mikrolitrów buforu do elektroporacji i inhibitora ROCK do kuwety, a następnie przenieś całą jej zawartość do 1,5-mililitrowej probówki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby komórki mogły się zregenerować. Po 30 minutach wiruj z prędkością 400G przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach na studzienkę matrycy piwnicznej. Wysiewaj około 1 x 10⁴ do 1 x 10⁵ komórek na studzienkę na 48-dołkową płytkę i dodaj EGF plus inhibitor Noggin GSK-3, inhibitor ROCK i 1,25% pożywki dimetylosulfotlenku. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.