Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu zliczenia bakteriofagów

Aby zliczyć bakteriofagi za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy, qPCR, należy otrzymać koktajl reakcyjny qPCR zawierający polimerazę DNA Taq, startery, trifosforany deoksynukleotydowe - dNTP - i fluorescencyjne cząsteczki barwnika reporterowego w zoptymalizowanym buforze. Przenieść do dołków płytki qPCR.

Dodaj bakteriofagi poddane obróbce cieplnej. Obróbka cieplna uwalnia DNA bakteriofaga z cząstek bakteriofagów. Uszczelnij płytę, zapobiegając parowaniu mieszaniny. Załaduj płytkę do systemu qPCR, ustawiając odpowiednie warunki cykliczne.

Ogrzewanie do wysokich temperatur denaturuje dwuniciowe DNA na pojedyncze nici. Aktywuje również polimerazę DNA Taq. Wyżarzanie powoduje, że startery specyficzne dla sekwencji wiążą się z komplementarnymi niciami DNA bakteriofagów. Rozszerzenie umożliwia aktywowanej polimerazie DNA Taq dodanie dNTP do końca 3' startera, przedłużając rosnącą nić DNA w kierunku od 5' do 3'.

Cząsteczki barwnika interkalują w nowo zsyntetyzowanym dwuniciowym DNA, powodując zwiększoną intensywność fluorescencji. Każdy cykl PCR podwaja docelową ilość DNA, zwiększając intensywność fluorescencji.

Określ cykl progowy, wartość Ct, przy której mierzona fluorescencja przekracza poziom tła.

Wartość Ct jest odwrotnie proporcjonalna do wyjściowej ilości DNA, przy czym każdy genom bakteriofaga jest równoważny jednej cząstce bakteriofaga, co ułatwia kwantyfikację bakteriofagów na podstawie krzywej wzorcowej DNA bakteriofaga.

Po amplifikacji przeprowadzić analizę krzywej topnienia, stopniowo zwiększając temperaturę reakcji. W określonej temperaturze topnienia połowa DNA rozdziela się na pojedyncze nici, uwalniając cząsteczki barwnika i powodując nagły spadek fluorescencji.

Wyraźna temperatura topnienia, unikalna dla produktu qPCR, potwierdza specyfikę produktu.