Reakcja łańcuchowa polimerazy mikrosferycznej w celu amplifikacji jednoniciowego DNA

Microsphere-PCR wykorzystuje mikrokulę sprzężoną z oligonukleotydami na ich powierzchni, co umożliwia preferencyjną amplifikację jednoniciowego DNA.

Aby rozpocząć mikrosferyczny PCR, weź mieszaninę reakcyjną zawierającą matrycowe jednoniciowe nici DNA, startery do przodu z dodatkowym znacznikiem nukleotydowym, termostabilną polimerazę DNA, dNTP i mikrosfery wyświetlające jednoniciowe sondy oligonukleotydowe.

Umieść probówkę w termocyklerze i pracuj w określonych warunkach.

W pierwszym cyklu, w temperaturze wyżarzania, matryca DNA wiąże się z sondą na powierzchni mikrosfery w taki sposób, że matryca DNA działa jako nić wyczuwalna. Podczas rozciągania polimeraza wydłuża DNA, a dupleks pozostaje przyłączony do mikrosfery.

W następnym cyklu, podczas denaturacji, matrycowy DNA oddziela się od mikrosfery, pozostawiając nić sondy związaną z powierzchnią - służącą jako matryca dla nowej nici.

Podczas wyżarzania oznaczony podkład wiąże się z pasmem antysensownym. Później polimeraza wydłuża go, aby zsyntetyzować nić sensacyjną ze znacznikiem nukleotydu.

Powtórz cykl kilka razy, aby wygenerować wiele kopii jednoniciowego DNA, które trafiają do roztworu, podczas gdy dwuniciowe zanieczyszczenia pozostają przyłączone.

Przenieść produkty PCR do probówki zawierającej bufor ładujący. Załaduj produkt i markery do różnych dołków żelu i oddziel za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Matrycowe DNA tworzą słabe pasmo o niskiej masie cząsteczkowej, podczas gdy intensywne pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej potwierdza amplifikację jednoniciowego DNA.