Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy - lub dPCR - jest przydatna do ilościowego określania wariantów pojedynczego nukleotydu - lub SNV - mutacji, w której podstawienie pojedynczego nukleotydu w określonej pozycji w genomie tworzy dwie odmiany nukleotydowe lub allele.

Aby rozpocząć kwantyfikację przy użyciu techniki dPCR typu chip-in-a-tube, należy pobrać próbkę DNA zawierającą SNV — zmutowany allel i odpowiadający mu allel typu dzikiego. Dodaj mieszaninę zawierającą termostabilny enzym polimerazę DNA, dNTP i startery.

Następnie dodaj sondy oligonukleotydowe specyficzne dla alleli - oznaczone reporterami o różnokolorowej fluorescencji w celu rozróżnienia alleli - i cząsteczkę wygaszającą. Bliskość wygaszacza do reportera hamuje jego fluorescencję.

Podziel roztwór na komory reakcyjne chipa mikroprzepływowego. Każda komora zawierająca allel służy jako niezależne naczynie reakcyjne.

Umieść rurkę z chipem w termocyklerze i rozpocznij reakcję. W wysokiej temperaturze dwuniciowe DNA ulega denaturacji na pojedyncze nici. Obniż temperaturę, aby wyżarzyć startery i sondy oligonukleotydowe do ich komplementarnych regionów.

W odpowiedniej temperaturze rozciągnięcia polimeraza DNA rozciąga startery i rozszczepia sondę. Odległość od wygaszacza umożliwia emisję fluorescencji reportera.

Odczytaj różnokolorowe sygnały fluorescencyjne i utwórz wykres pozycji, aby wykryć komory zawierające allele.

Aby określić częstość występowania zmutowanego allelu - frakcji wariantu allelu - oblicz stosunek komór zawierających mutanta do allelu typu dzikiego.