Test Dot Blot w celu ilościowego określenia genomu wirusa

Aby określić ilościowo DNA wirusa za pomocą testu igłowego, należy rozpocząć od izolowanej zawiesiny wirusowego DNA. Potraktuj roztworem alkalicznym, aby zdenaturować dwuniciowe DNA na pojedyncze nici w celu późniejszej hybrydyzacji.

Zmontuj aparat do igrania w kropki ze wstępnie zwilżoną membraną nylonową. Załaduj zdenaturowane DNA wirusa i zlinearyzowane standardowe roztwory plazmidowego DNA do studzienek. Zastosuj odpowiednią próżnię, ułatwiając skuteczny transfer jednoniciowego wirusowego DNA naładowanego ujemnie i wiążąc się z dodatnio naładowaną powierzchnią błony poprzez oddziaływania elektrostatyczne, tworząc wzory kropek.

Po przebiegu przemyj membranę buforem cytrynianu sodu, co pomaga poprawić czułość testu. Po wysuszeniu wystaw membranę na działanie światła ultrafioletowego, sieciując plamiste DNA z membraną.

Dodaj do błony zdenaturowany termicznie, nieheterologiczny fragment DNA i specyficzną dla genomu wirusa, radioaktywną zawiesinę sondy DNA znakowaną fosforem w buforze hybrydyzacyjnym. Inkubuj, ułatwiając hybrydyzację.

Fragmenty DNA działają jako środki blokujące, wiążąc się z pozostałymi regionami błony, minimalizując niespecyficzne wiązanie sondy. Radioaktywna sonda hybrydyzuje z komplementarną sekwencją na jednoniciowym DNA wirusa.

Przemyć buforem do mycia, aby usunąć niehybrydyzowane sondy. Korzystając z systemu skanowania obrazów luminoforowych, określ ilościowo sygnały radioaktywne emitowane przez sondy radioaktywne zhybrydyzowane z genomem wirusa na membranie, aby uzyskać sygnały dot blot.

Na podstawie krzywej standardowej intensywność sygnału każdej kropki na membranie można wykorzystać do obliczenia ilości wirusowego DNA w próbce.