5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Metylacja DNA to modyfikacja epigenetyczna, która polega na dodaniu grupy metylowej do zasady cytozynowej DNA w celu wytworzenia 5-metylocytozyny. Ta modyfikacja zmienia ekspresję genu.

Aby określić ilościowo metylację DNA za pomocą dot-blot, należy pobrać próbki genomowego DNA pochodzące z ludzkich chondrocytów na różnych etapach dedyferencjacji, które wykazują różne poziomy metylowanej cytozyny.

Potraktuj próbki DNA wodorotlenkiem sodu - silną zasadą - i podgrzej je. Zabieg ten zrywa wiązania wodorowe między dwiema niciami DNA, powodując denaturację DNA. Dodaj octan amonu, aby zneutralizować zasadę, zapobiegając nadmiernej degradacji DNA.

Weź nylonową membranę i umieść zdenaturowane próbki DNA jako kropki. Ujemnie naładowany DNA wiąże się z dodatnio naładowaną membraną nylonową poprzez oddziaływania elektrostatyczne, co powoduje jego zabrudzenie na stałym podłożu.

Potraktuj osuszoną błonę buforem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Następnie dodaj przeciwciała anty-5-metylocytozyny do błony i inkubuj. Przeciwciała te wiążą się wyłącznie z metylowaną cytozyną na DNA.

Przemyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała i dodać chemiluminescencyjne przeciwciała drugorzędowe sprzężone z enzymami, które specyficznie wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Dodaj podłoże chemiluminescencyjne na membranę. Enzym na przeciwciałie reaguje z substratem, tworząc chemiluminescencję - dając kropki o różnej intensywności.

Zobrazuj błonę i zmierz intensywność kropek, która odpowiada zakresowi metylacji DNA w każdej próbce.