Ilościowa plama punktowa w celu oszacowania docelowych białek w lizacie tkankowym

Ilościowa plama punktowa — lub QDB — jest przydatną techniką ilościowego określania stężenia docelowych białek w próbce. Po unieruchomieniu próbki na membranie polimerowej białka można wykryć za pomocą immunoblottingu.

Na początek weź płytkę QDB - płytkę wielodołkową z membraną nitrocelulozową przymocowaną do dna każdej studzienki. Dodać próbkę — lizat tkankowy zawierający białko docelowe — w środku błony wewnątrz studzienki.

Pozostawić próbkę do wyschnięcia. Białko docelowe wiąże się z błoną poprzez oddziaływania niekowalencyjne

Dodaj rozwiązanie blokujące. Białka w roztworze przyłączają się do niezwiązanych miejsc na błonie, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu odczynników wykrywających.

Następnie dodaj roztwór zawierający przeciwciała pierwszorzędowe, które wiążą się z białkiem docelowym w próbce. Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Następnie dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciała. Cząsteczki te - znakowane enzymem peroksydazy - wiążą się z pierwotnymi przeciwciałami związanymi z białkiem. Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Na koniec dodaj roztwór zawierający podłoże chemiluminescencyjne i nadtlenek wodoru. Wykorzystując nadtlenek wodoru, peroksydaza związana z przeciwciałami utlenia substrat i emituje światło. Za pomocą czytnika płytek zmierz natężenie luminescencji próbki.

Wygeneruj standardową krzywą luminescencji, używając szeregowego rozcieńczenia ze znanymi stężeniami białka docelowego. Wykreślić zmierzoną wartość luminescencji próbki na krzywej, aby określić docelowe stężenie białka.