Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Ilościowy western blotting - technika oparta na normalizacji białka całkowitego - jest przydatna do ilościowego określania docelowych poziomów ekspresji białka.

Na początek załaduj lizat tkankowy do studzienek żelu gradientowego z poliakrylamidu. Lizat zawiera białko docelowe wraz z innymi białkami komórkowymi.

Uruchomić żel pod odpowiednim napięciem w celu elektroforetycznego rozdzielenia białek próbki wzdłuż gradientu. Po zakończeniu umieść żel na membranie polimerowej stosu transferowego.

Zastosuj prąd elektryczny, aby przenieść oddzielone białka na błonę. Następnie umieść membranę w fluorescencyjnym barwieniu białka całkowitego. Naładowane cząsteczki barwnika w barwieniu wiążą się elektrostatycznie ze wszystkimi białkami na błonie.

Dodaj rozwiązanie blokujące. W ten sposób białka w roztworze wiążą się z błoną. zapobieganie niespecyficznemu wiązaniu odczynników wykrywających. Dodaj pierwszorzędowe przeciwciało wiążące się tylko z białkiem docelowym. Następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe - znakowane fluoroforem - które przyłącza się do przeciwciała pierwszorzędowego.

Wzbudzić próbkę za pomocą lasera. Zarejestrować emitowaną fluorescencję z cząsteczek barwnika całkowitego barwienia białka i fluoroforów związanych z przeciwciałami na odpowiednich długościach fal.

Aby obliczyć znormalizowaną wartość obciążenia białka, podziel całkowity sygnał białkowy każdego pasma przez najwyższą wartość. Podziel sygnał białka docelowego przez odpowiednią znormalizowaną wartość obciążenia, aby określić względną ekspresję białka docelowego.