Western blotting pojedynczych komórek w celu określenia heterogeniczności komórek

Miejsca zapalne zawierają różne komórki odpornościowe, w tym monocyty, makrofagi i leukocyty.

Aby zidentyfikować heterogeniczną populację komórek za pomocą jednokomórkowego western blotting, należy pobrać wstępnie uwodniony chip do bibuły, składający się z fotoaktywowanego żelu poliakrylamidowego uformowanego w bloki. W każdym bloku znajdują się liczne mikrodołki. Tworzenie wzoru w kilku blokach przechwytuje wiele komórek równolegle.

Dodać zawiesinę zawierającą niejednorodną populację komórek. Wymiary studni pozwalają na osiedlanie się pojedynczych komórek. Zanurz chip w komorze elektroforetycznej wypełnionej odpowiednim buforem. Cząsteczki detergentu w buforze rozrywają błonę komórkową, uwalniając zawartość komórkową.

Zastosuj pole elektryczne. Uwolnione białka migrują przez żel, rozdzielając się na pasma o różnej wielkości. Umyj chip buforem myjącym, aby usunąć niespecyficznie związane cząsteczki, pozostawiając tylko białka komórkowe, w tym pożądane białka markerowe.

Wystaw żel na działanie światła UV, aktywując jego powierzchnię i unieruchamiając białka.

Dodaj koktajl przeciwciał pierwszorzędowych, które wiążą się specyficznie z białkami markerowymi charakterystycznymi dla każdego typu komórki, tworząc kompleksy przeciwciał białkowo-pierwotnych. Dozować mieszaninę znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych, które wiążą odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe, znakując odpowiednie białko markerowe specyficzne dla komórki.

Umieść chip w skanerze. Zmierzyć intensywność fluorescencji, która jest proporcjonalna do poziomu ekspresji odpowiedniego markera białkowego specyficznego dla pojedynczej komórki zawiesiny próbki komórkowej.