Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

CD95 ― receptor śmierci ― wiąże się ze swoimi agonistycznymi przeciwciałami, wywołując tworzenie wywołującego śmierć kompleksu sygnalizacyjnego lub DISC ― wielobiałkowego kompleksu, który rekrutuje prokaspazę 8. W DISC prokaspaza 8 dimeryzuje i przetwarza się, tworząc różne pośrednie produkty rozszczepienia, a na końcu aktywną formę, która inicjuje apoptozę.

Aby przeanalizować przetwarzanie kaspazy-ósemki za pomocą chemiluminescencyjnego western blot, należy pobrać lizat zawierający pośrednie produkty rozszczepienia kaspazy 8 związane z DISC w probówce. Uzupełnij to białkiem A-agarozy o przeciwciała anty-CD95 wychwycone przez kulki A. Przeciwciała anty-CD95 wiążą się ze składnikiem DISC ― CD95, tworząc kompleksy białkowe.

Załaduj próbkę na żel poliakryloamidowy SDS, aby oddzielić różnej wielkości immunoprecypitowane produkty pośrednie kaspazy 8 jako odrębne prążki. Umieść żel na membranie bibułkowej i przyłóż prąd elektryczny. Półprodukty kaspazy 8 wydostają się z żelu na błonę bibułową.

Potraktuj błonę roztworem zawierającym białko blokujące, aby nasycić miejsca wiązania białek ― zapobiegając niespecyficznym wiązaniom.

Dodaj roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, które wiążą się z produktami kaspazy-ośmiu w określonym miejscu.

Dodaj znakowane enzymatycznie przeciwciała drugorzędowe, które specyficznie wiążą się z komplementarnym regionem Fc przeciwciała pierwszorzędowego, tworząc kompleks kaspazy-ósemki-produktu rozszczepienia ósemkowego-pierwotnego przeciwciała-przeciwciała drugorzędowego.

Dodaj substrat chemiluminescencyjny, który reaguje z drugorzędowym enzymem sprzężonym z przeciwciałami i emituje światło. Natężenie emitowanego światła koreluje z ilością produktu rozszczepienia kaspazy-ósemki.