Southern blotting w celu wykrycia rekombinacji homologicznej w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy

Southern blotting polega na identyfikacji określonych sekwencji DNA ze złożonej mieszanki DNA za pomocą detekcji opartej na sondzie.

Aby zidentyfikować rekombinację homologiczną lub zdarzenia HR w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z Southern blot, należy uzyskać genomowe DNA z komórek. Inkubuj z enzymem restrykcyjnym, aby strawić DNA na mniejsze fragmenty.

Załaduj DNA na żel agarozowy. Wykonaj elektroforezę w celu separacji fragmentów na podstawie wielkości.

Potraktuj żel kwaśnym roztworem, aby usunąć zasady purynowe, rozluźniając dwuniciowe DNA, dsDNA. Dodaj alkaliczny roztwór denaturujący. Wysokie pH rozrywa wiązania wodorowe, denaturując rozluźnione dsDNA na jednoniciowe DNA, ssDNA. Inkubować z roztworem neutralizującym, aby zneutralizować pH żelu.

Zmontuj system transferowy za pomocą bibuły, nylonowej membrany i żelu ułożonego na wierzchu membrany. Wykonaj transfer. ssDNA przenosi się z żelu do błony poprzez działanie kapilarne w dół.

Naświetlić błonę promieniami ultrafioletowymi, sieciując i unieruchamiając DNA. Umieść membranę w probówce zawierającej roztwór hybrydyzacyjny. Inkubować z rotacją, pokrywając membranę i zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu sondy.

Na koniec inkubować błonę z buforem hybrydyzacyjnym zawierającym jednoniciowe, znakowane radioaktywnie sondy. Sondy wiążą się z określonymi regionami DNA poprzez komplementarność sekwencji.

Umyj membranę, usuwając niezwiązane sondy. Wystaw membranę na działanie promieni rentgenowskich. Wyraźne prążki na błonie odróżniają regiony DNA zawierające zdarzenia HR od regionów kontrolnych.