Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

Aby wykonać western blot, dodaj 20 mikrolitrów bufora ładującego 4X do kulek i podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Jednocześnie podgrzewaj kontrole lizatu w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut. Załaduj lizaty, immunoprecypitanty i wzorzec białkowy do 12,5% żelu SDS i pracuj ze stałym napięciem 80 woltów.

Po zakończeniu przebiegu żelu przenieś białka z żelu SDS do membrany nitrocelulozowej. Po zakończeniu transferu umieścić osuszoną błonę w pudełku i inkubować ją przez godzinę w roztworze blokującym, pod delikatnym mieszaniem. Następnie umyj membranę trzy razy przez 5 minut PBST.

Aby wykryć białka, dodaj pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe we wskazanym rozcieńczeniu do błony i inkubuj je przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem. Następnego dnia przemyj membranę trzema 5-minutowymi płukaniami PBST, a następnie inkubuj membranę z 20 mililitrami przeciwciała wtórnego, delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Ponownie umyj membranę trzykrotnie PBST. Po odrzuceniu ostatniego płukania PBST dodaj około 1 mililitra substratu z nadtlenku chrzanu do membrany i wykryj sygnał chemoluminescencyjny.