Southern blotting w celu wykrycia rekombinacji homologicznej w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy

Dla każdego gDNA wymieszaj 30 mikrolitrów 10-krotnego buforu dla Dra I, trzech mikrolitrów Dra I i 10 mikrogramów gDNA na próbkę. Dodaj wodę, aż ostateczna objętość wyniesie 30 mikrolitrów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby strawić gDNA.

Przygotuj 1% żel do elektroforezy agarozowej z bromkiem etydyny. Załaduj wcześniej pobrane próbki wraz z drabinką 1 Kb na żel i uruchom go pod napięciem od 30 do 40 woltów przez noc. Następnego dnia namocz żel w tacce zawierającej roztwór kwasu solnego o stężeniu 0,2 Newtona. Użyj shakera, aby delikatnie potrząsnąć tacą przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Przenieść żel do tacki zawierającej roztwór denaturujący DNA. Wstrząsaj delikatnie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś żel do tacki zawierającej roztwór neutralizujący DNA i delikatnie potrząsaj nim przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Korzystając z systemu szybkiego transferu w dół, przenieś DNA z żelu do błony.

Następnie zmontuj TurboBlotter i stos bibuły zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Następnie wyjmij membranę i przemyj ją 2X roztworem soli fizjologicznej i cytrynianu sodu przez jedną minutę. Wchłoń płyn za pomocą tkanek, a następnie użyj środka sieciującego UV, aby usieciować DNA z błoną.

Aby rozpocząć znakowanie sond DNA radioaktywnością, dodaj denaturowane termicznie DNA sondy do probówki zawierającej gotowe do użycia kulki do znakowania DNA. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać i dodać 5 mikrolitrów znakowanego radioaktywnie trifosforanu deoksycytozyny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez piętnaście minut. Oczyść oznakowane sondy za pomocą mikrokolumn G-50, zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Użyj licznika scyntylacyjnego, aby zmierzyć radioaktywność.

Aby rozpocząć hybrydyzację membran za pomocą oznakowanych sond, umieść membranę w probówce hybrydyzacyjnej. Dodaj mieszany roztwór do hybrydyzacji. Umieść probówkę w piecu do hybrydyzacji i pozwól wstępnej hybrydyzacji postępować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie wyjmij rurkę z piekarnika i wlej roztwór do hybrydyzacji do 50-mililitrowej probówki. Dodaj denaturowaną sondę i delikatnie wymieszaj. Dodaj mieszany roztwór hybrydyzacyjny do probówki do hybrydyzacji i włóż probówkę z powrotem do pieca do hybrydyzacji. Następnie pozwól, aby hybrydyzacja postępowała przez noc.

Aby usunąć niehybrydyzowane sondy, umieść membranę na tacy zawierającej 1x cytrynian soli fizjologicznej z 0,1% SDS i delikatnie wstrząsaj w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie owiń membranę folią i zamocuj ją w kasecie ekspozycyjnej. W ciemnym pomieszczeniu wystaw membranę na 2 arkusze kliszy rentgenowskiej. Wywołaj film, aby zwizualizować wyniki.