Name: Modele kohodowli biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych ludzkich komórkach dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Poznaj metody hodowli biofilmów Pseudomonas aeruginosa na żywych ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych. Technika ta umożliwia wizualizację fluorescencyjną i ocenę cytotoksyczności, wspierając badania nad zakażeniami oddechowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować G. O Toole za wskazówki i sugestie przy opracowywaniu tych modeli. Praca ta była finansowana przez Cystic Fibrosis Foundation (granty ANDERS06F0 dla G.G.A., STANTO07RO oraz STANTO08GA dla B.A.S.), National Institutes of Health (granty T32A107363 dla G.G.A. oraz R01-HL074175 dla B.A.S.) oraz National Center for Research Resources Centers for Biomedical Research Excellence (grant COBRE P20-RR018787 dla B.A.S.).

1. Statyczny model biofilmu w kokulturze
<ol>
 <li>Statyczny model biofilmu w ko-kulturze1 wykorzystuje komórki CFBE41o- (komórki CFBE), które są komórkami unieśmiertelnionymi, pierwotnie wyhodowanymi od osoby z mukowiscydozą homozygotyczną pod kątem mutacji ΔF508-CFTR 2,3,4. Komórki CFBE należy wysiać w stężeniu 106 komórek/dołek w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej lub 2 X 105 w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w minimalnym medium niezbędnym (MEM) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2mM L-glutaminy, 50 U/mL penicyliny i 50 μg/mL streptomycyny. Stosujemy 1,5 mL medium na dołek w płytkach 6-dołkowych oraz 0,5 mL medium na dołek w płytkach 24-dołkowych.</li>
 <li>Komórki należy hodować w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2-95% powietrza przez 7-10 dni do czasu utworzenia zwartej monowarstwy przed inokulacją bakteriami. Medium należy wymieniać co 2-3 dni. Wykazano, że warunki te prowadzą do powstania zwartej monowarstwy i połączeń ścisłych.</li>
 <li>Hodować P. aeruginosa w 5 mL pożywki LB przez 18 godzin w 37°C na inkubatorze z wytrząsarką przy 200 rpm. W tych warunkach kultury P. aeruginosa zazwyczaj osiągają gęstość 5x109 CFU/ mL.</li>
 <li>W celu inokulacji bakteryjnej należy usunąć medium z komórek CFBE i dodać taką samą objętość MEM bez czerwieni fenolowej, uzupełnionego o 2 mM L-glutaminy (medium do mikroskopii). Zwarte monowarstwy CFBE inokuluje się P. aeruginosa przy wielokrotności infekcji wynoszącej około 30:1 w stosunku do liczby pierwotnie wysianych komórek CFBE. Odpowiada to 2 X 107 CFU/mL w 1,5 mL MEM/dołek dla płytek 6-dołkowych i 1,2 X 107 CFU/mL w 0,5 mL MEM/dołek dla płytek 24-dołkowych.</li>
 <li>Inkubować płytki przez 1 godzinę w 37°C i 5% CO2-95% powietrza.</li>
 <li>Po 1-godzinnej inkubacji należy usunąć nadsącz i zastąpić go świeżym medium do mikroskopii uzupełnionym o 0,4% argininy.</li>
 <li>Inkubować w 37°C i 5% CO2-95% powietrza przez różne odstępy czasu (do około 8 godzin) i analizować integralność monowarstwy CFBE za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej. Jeśli komórki dróg oddechowych nie tworzą zwartej warstwy, P. aeruginosa szybko (w ciągu kilku minut) uzyska dostęp do powierzchni bazolateralnej komórek i zniszczy ich integralność. Inokulacja szczepami P. aeruginosa konstytutywnie eksponującymi GFP prowadzi do powstania fluorescencyjnych mikrokolonii biofilmu, które można wizualizować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.</li>
 <li>Liczbę CFU bakterii w biofilmie można określić, przemywając ko-kulturę 2-3 razy solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aby wyeliminować bakterie planktoniczne. Po przemyciu należy traktować 0,1% Triton X-100 w PBS lub MEM przez 10-15 minut w celu lizy komórek nabłonkowych i rozproszenia biofilmu.</li>
 <li>Mieszać w vortexie przez 3 minuty i przygotować rozcieńczenia seryjne lizatu. Wysiać te rozcieńczenia na agar LB i inkubować przez noc w 37°C. Następnego dnia policzyć kolonie, aby określić liczbę CFU.</li>
</ol>
2. Model biofilmu w układzie współhodowli w komorze przepływowej
<ol>
 <li>Model biofilmu w ko-kulturze w komorze przepływowej (test przepływowy) obejmuje modyfikację standardowego aparatu do badania biofilmu w komorze przepływowej w celu dostosowania go do komórek CFBE5.</li>
 <li>Umieść kilka szklanych lamellek o średnicy 40 mm w czystym zlewce o pojemności 100 mL. Szczelnie przykryj 2 warstwami folii aluminiowej i autoklawuj w cyklu suchym przez 20 min.</li>
 <li>Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wyjmij jedną sterylną lamelkę ze zlewki za pomocą wypłukanych etanolem pęsety i umieść ją w sterylnym plastikowym naczyniu o średnicy 60 mm.</li>
 <li>Dodaj 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki do wzrostu komórek, dociskając lamelkę końcówką pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod nią i docisnąć lamelkę do dna plastikowego naczynia.</li>
 <li>Zasiej 2x106 komórek na naczynie i delikatnie potrząśnij naczyniem w przód i w tył. Unikaj wirowania, aby zapobiec osadzaniu się komórek przy ściankach naczynia.</li>
 <li>Umieść naczynie w inkubatorze z 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37°C i dokarmiaj komórki co drugi dzień 3 mL świeżej pożywki wzrostowej przez 8 do 10 dni. Komórki utworzą zlewne warstwy jednowarstwowe na szklanej lamelce.</li>
 <li>Hoduj P. aeruginosa w 5 mL LB przez 18 godzin w 37°C w inkubatorze z wytrząsarką przy 200 rpm. W tych warunkach kultury P. aeruginosa zazwyczaj osiągają gęstość 5x109 CFU/mL. Używamy szczepu P. aeruginosa PAO1 niosącego plazmid pSMC21 do konstytutywnej ekspresji GFP6.</li>
 <li>Dodaj 1 mL kultury bakteryjnej do sterylnej probówki do mikrocentryfugi. Centryfuguj przy 6000 rpm przez 3 min, a następnie dwukrotnie wypłucz osad bakteryjny w 1 mL pożywki do mikroskopii (Microscopy medium).</li>
 <li>Rozcieńcz 0,5 mL wypłukanych i resuspenderowanych bakterii w 4,5 mL pożywki do mikroskopii, aby uzyskać stężenie ~5x108 CFU/mL.</li>
 <li>Obserwacja żywych komórek w czasie rzeczywistym wymaga komory obrazującej połączonej z pompą perystaltyczną (aby zapewnić przepływ składników odżywczych przez dłuższy czas) oraz kontrolerem temperatury. Używamy komory Bioptechs FCS2 (Focht Live-Cell) podłączonej do mikropompy perfuzyjnej o niskim przepływie z rurkami C-flex o średnicy 1/16th dociętymi do odpowiedniej długości i autoklawowanymi w celu sterylizacji, z regulacją temperatury za pomocą kontrolera komory FCS2. Źródło pożywki przechowujemy w łaźni wodnej o temperaturze 37°C znajdującej się bezpośrednio obok mikroskopu.</li>
 <li>Zmontuj komorę przepływową. Komora FCS2 zawiera samoblokującą podstawę (która spoczywa na adapterze stolika podczas obrazowania) oraz górną część połączoną z rurkami perfuzyjnymi i kontrolerem komory. Komorę montuje się do góry nogami, a następnie obraca i umieszcza na adapterze stolika. Trzymaj górną część komory do góry nogami tak, aby rurki perfuzyjne były widoczne, i dopasuj otwory prześwitowe gumowej uszczelki o grubości 0,75 mm do rurek perfuzyjnych. Na gumowej uszczelce ułóż dostarczone z komorą szkiełko z mikroakweduktem, upewniając się, że strona z rowkiem jest skierowana do góry, a następnie na szkiełko połóż drugą gumową uszczelkę. Grubość i geometria wewnętrzna tej drugiej uszczelki określą objętość komory. Zazwyczaj stosujemy gumową uszczelkę o grubości 0,75 mm z okrągłą geometrią wewnętrzną o średnicy 30 mm.</li>
 <li>Dodaj 1 mL uprzednio ogrzanej (37°C) pożywki do mikroskopii na środek szkiełka.</li>
 <li>Wyjmij naczynie 60-mm z inkubatora do hodowli komórkowych, usuń zużytą pożywkę i wypłucz komórki raz 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki do mikroskopii. Krok ten zapewnia usunięcie czerwieni fenolowej i antybiotyków obecnych w pożywce wzrostowej. Czerwień fenolowa wykazuje słabą fluorescencję i może zakłócać obrazowanie, natomiast antybiotyki mogą zniszczyć bakterie P. aeruginosa przed utworzeniem przez nie biofilmu.</li>
 <li>Używając wypłukanej etanolem pęsety, wyjmij lamelkę z naczynia i opuść ją do góry nogami na kroplę pożywki do mikroskopii umieszczonej w komorze. Lamelka spoczywa teraz na drugiej gumowej uszczelce, a monowarstwa komórek dróg oddechowych jest skierowana w dół.</li>
 <li>Trzymając zmontowane elementy w jednej ręce, połóż podstawę komory na wierzchu stosu i szybko obróć komorę, aby wszystko znajdowało się w odpowiedniej pozycji. Zablokuj podstawę, obracając pierścieniem.</li>
 <li>Podłącz rurkę wlotową do mikropompy perfuzyjnej o niskim przepływie i uruchom przepływ z prędkością 20 mL/h; prędkość ta mieści się w zakresie zdolności pływania P. aeruginosa. Drugi odcinek rurki łączy pompę z kolbą z pożywką do mikroskopii umieszczoną w łaźni wodnej 37°C obok mikroskopu.</li>
 <li>Przymocuj sterylne, docięte rurki C-Flex 1/16th do wlotowych i wylotowych rurek perfuzyjnych komory, podłącz kontroler temperatury, a następnie umieść zmontowaną komorę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
 <li>Używając jednorazowej strzykawki 1-mL, wstrzyknij wcześniej przygotowaną zawiesinę bakteryjną do komory, korzystając z zaworu dwudrożnego umieszczonego w linii między pompą a komorą. W naszej konfiguracji potrzeba 0,6 mL zawiesiny bakteryjnej, aby dotarła ona do komory. Dostosuj tę objętość do długości rurek w Twoim układzie. Uznajemy również za przydatne umieszczenie jednorazowego filtra 0,22 μm w linii między pompą a zaworem dwudrożnym, aby zapobiec płynięciu bakterii pod prąd i zanieczyszczeniu kolby zasilającej.</li>
 <li>Aby umożliwić bakteriom przytwierdzenie się do komórek dróg oddechowych, zatrzymaj pompę na 2 h. Przepływ można następnie wznowić i utrzymywać na poziomie 20 mL/h przez resztę eksperymentu.</li>
 <li>Przez cały czas trwania eksperymentu monitoruj integralność komórek dróg oddechowych za pomocą mikroskopii kontrastowo-fazowej (DIC), aby sprawdzić, czy nie pojawiły się oznaki uszkodzenia monowarstwy. Jednocześnie śledź rozwój biofilmu P. aeruginosa znakowanego GFP na powierzchni apikalnej komórek dróg oddechowych, wykonując obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego w szerokim polu.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Używamy szczepu P. aeruginosa zawierającego plazmid pSMC21, który umożliwia konstytutywną ekspresję GFP6. Dzięki temu biofilmy znakowane GFP, rosnące na monowarstwie CFBE, można wizualizować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Alternatywnie wizualizację biofilmu można przeprowadzić poprzez barwienie nieznakowanego P. aeruginosa 1% roztworem calcofluor white przez 1 godzinę w 37°C1.
Do obrazowania tworzenia biofilmu na komórkach CFBE w teście przepływowym wykorzystujemy adapter stolika wykonany na zamówienie, jednak obecnie wiele firm oferuje specjalnie dopasowane adaptery stolików. Pracujemy z odwróconym mikroskopem Olympus IX70 wyposażonym w kamerę CCD z głębokim chłodzeniem ORCA-AG oraz obiektywem imersyjnym olejowym x60 (apertura numeryczna 1,40). Koło filtrowe wyposażone jest w filtr wzbudzenia pasmowego 480/40 nm oraz filtr emisyjny pasmowy 535/30 nm. Obrazy cyfrowe pozyskano za pomocą pakietu oprogramowania OpenLab 4.0.3 (Improvision), a objętości poddano dekonwolucji poprzez iteracyjną rekonstrukcję z wykorzystaniem oprogramowania Volocity 3.5.1 (Improvision). Analizę ilościową trójwymiarowych struktur biofilmu przeprowadzono za pomocą pakietu oprogramowania do analizy obrazu COMSTAT7,8.
W przypadku każdego rozważanego modelu kokultury należy zwrócić szczególną uwagę na cytotoksyczność rozwijającą się pomiędzy komponentami modelu. Zarówno w testach statycznych, jak i w komorach przepływowych stwierdzono, że monowarstwa CFBE może znosić obecność P. aeruginosa do 8 godzin po inokulacji bez żadnych oznak zmian. Integralność monowarstwy nabłonka można oceniać za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej przy użyciu mikroskopu odwróconego1 (Rycina 1A) lub mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) przez cały czas trwania eksperymentu5. Z czasem P. aeruginosa będzie produkować toksyny i czynniki wirulencji, które kumulują się i mogą uszkodzić monowarstwę komórek nabłonka w całości lub fragmentarycznie (Rycina 1B-1C). Cytotoksyczność można ocenić ilościowo, stosując różne zestawy do pomiaru uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) z komórek nabłonka. LDH jest stabilnym enzymem cytozolowym uwalnianym do środowiska zewnątrzkomórkowego w wyniku lizy lub śmierci komórki.
Gdy integralność warstwy komórek nabłonka dróg oddechowych nie jest naruszona (zazwyczaj przez ok. 8 h po inokulacji), biofilmy P. aeruginosa mogą skutecznie tworzyć się i rozwijać na powierzchni apikalnej komórek dróg oddechowych w obu opisanych modelach kokultury (Rysunek 2A-2B). Po rekonstrukcji 3D (Rysunek 2C) i kwantyfikacji można precyzyjnie określić akumulację biomasy. Wykorzystaliśmy te biofilmy w kokulturze w kilku testach fenotypowych. Na przykład, jak wspomniano wcześniej, CFU biofilmu można łatwo określić poprzez lizę komórek nabłonkowych, seryjne rozcieńczanie lizatu i wysiew na płytki agarowe. Znaleźliśmy tę technikę korzystną przy określaniu oporności różnych szczepów na leczenie antybiotykami. Ponadto toksyczność biofilmu wobec komórek nabłonkowych można zmierzyć przy użyciu komercyjnie dostępnych zestawów do wykrywania LDH. W ten sposób można ocenić rolę czynników wirulencji w toksyczności biofilmów. Systemy modelowe te umożliwiają również szereg zastosowań w analizie ekspresji genów, w tym badania fuzji promotorów, RT-PCR oraz analizę mikromacierzy1,5,9.
<img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="Badanie wzrostu komórek i fluorescencji, obrazy mikroskopowe; zielony sygnał wskazuje na ekspresję białka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Monowarstwa komórek CFBE oraz reprezentatywne obrazy naruszonej i uszkodzonej monowarstwy komórek dróg oddechowych w wyniku wzrostu biofilmu P. aeruginosa. (A) Reprezentatywny obraz konfluentnej monowarstwy komórek CFBE hodowanych w naczyniach do hodowli tkankowej, oceniony za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej. Pasek skali, 120 μm. (B) Przykład naruszonej monowarstwy CFBE. Mimo że monowarstwa nie wykazuje jeszcze wyraźnych widocznych oznak uszkodzenia, widać bakterie P. aeruginosa rozprzestrzeniające się między połączeniami ścisłymi komórek nabłonkowych i uzyskujące dostęp do błon basolateralnych. Formowanie biofilmu zazwyczaj nie udaje się w tych warunkach ze względu na degradację monowarstwy. Pasek skali, 20 μm. (C) Przykład przerostu biofilmu P. aeruginosa zaobserwowanego 24 h po inokulacji. Po pomyślnym wsparciu formowania biofilmu monowarstwa CFBE została nieodwracalnie uszkodzona i jest obecnie praktycznie nieobecna. Pozostały biofilm, rosnący jako płaska warstwa bakterii, widoczny jest przyczepiony do szkiełka podstawowego. Pasek skali, 20 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej przedstawiające pobieranie nanocząstek przez komórki; fluorescencja i kontrast fazowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Biofilmy P. aeruginosa wyhodowane na powierzchni apikalnej konfluentnych komórek CFBE z zastosowaniem statycznego modelu współhodowli biofilmu oraz modelu współhodowli biofilmu w komorze przepływowej. (A) Reprezentatywny obraz biofilmu P. aeruginosa wykazującego ekspresję GFP, wyhodowanego na konfluentnej warstwie jednowarstwowej komórek CFBE przy użyciu statycznego modelu współhodowli biofilmu, oceniony za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Obraz stanowi nałożenie kanału kontrastu fazowego i kanału fluorescencyjnego. Pasek skali, 35 μm. (B) Reprezentatywny obraz biofilmu P. aeruginosa znakowanego GFP, hodowanego przez 6 h na konfluentnej warstwie jednowarstwowej komórek CFBE z zastosowaniem modelu współhodowli biofilmu w komorze przepływowej. Aby ułatwić wizualizację warstwy jednowarstwowej dróg oddechowych, jądra komórkowe barwiono 10 μg/mL Hoechst 33342 (Molecular Probes) przez 30 min przed inokulacją P. aeruginosa. Obrazy scalone i pseudokolorowe analizowano za pomocą kontrastu interferencyjnego (DIC); przedstawiono odpowiadające im obrazy fluorescencyjne. Biofilmy, widoczne jako zielone skupiska przytwierdzone do powierzchni apikalnej komórek CFBE, są rozproszone w obrębie komórek dróg oddechowych. Pasek skali, 20 μm. (C) Trójwymiarowa rekonstrukcja stosów obrazów z serii z, pokazująca typowe struktury przypominające grzyby w 6-godzinnych biofilmach P. aeruginosa tworzących się na warstwie jednowarstwowej komórek CFBE. Pasek skali, 10 μm.

<ol><li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).</li>
<li>Bruscia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CF+cell+lines+corrected+at+DeltaF508-CFTR+locus+by+SFHR-mediated+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting.</a> Gene Ther. 9, 683-685 (2002).</li>
<li>Cozens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+chloride+secretion+in+polarized+immortal+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).</li>
<li>Hentchel-Franks, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+airway+cl-+secretion+in+human+subjects+by+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).</li>
<li>Moreau-Marquis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).</li>
<li>Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-component+regulatory+system+regulates+biofilm+maturation+and+type+III+secretion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 187, (2005).</li>
<li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).</li>
<li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+magnesium+transporter+MgtE+inhibits+transcription+of+the+type+III+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system.</a> Infect Immun. 78, (2010).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Overview of microbial biofilms.</a> J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li>
<li>Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection.</a> J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).</li>
<li>Ko, Y. H., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%3A+a+brief+look+at+some+highlights+of+a+decade+of+research+focused+on+elucidating+and+correcting+the+molecular+basis+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).</li>
<li>Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).</li>
<li>Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+their+options+open%3A+acute+versus+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signalling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis.</a> Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).</li>
<li>Gomez, M. I., Prince, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunistic+infections+in+lung+disease%3A+Pseudomonas+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Biofilmy są koloniami bakterii, które tworzą się w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Sygnały środowiskowe te prowadzą do globalnych zmian regulacyjnych w każdej bakterii, co skutkuje wiązaniem się z powierzchnią, agregacją, produkcją egzopolisacharydów oraz innymi fenotypami, takimi jak zwiększona oporność na antybiotyki10. W ciągu ostatnich kilku dekad wiele dowodów potwierdziło hipotezę, że biofilmy odgrywają istotną rolę w patogenezie przewlekłych infekcji. Przykładowo, powszechnie przyjmuje się, że P....

<table><tbody><tr><td>Komora FCS2 (Focht Live-Cell)</td><td>Bioptechs</td><td>060319131616</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik komory FCS2</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-0303</td><td></td></tr><tr><td>Szklane lamelki 40 mm</td><td>Bioptechs</td><td>PH 40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>#10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>Mediatech, Manassass, VA</td><td></td></tr></tbody></table>

modele kokultury biofilmów pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Biofilmy bakteryjne są powiązane z szeregiem różnych chorób ludzi, jednak rozwój biofilmu badano zazwyczaj na powierzchniach nieożywionych. W niniejszej pracy opisujemy protokoły tworzenia biofilmów Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórek nabłonkowych dróg oddechowych (komórki CFBE). W pierwszej metodzie (nazwanej statycznym modelem współhodowli biofilmu), P. aeruginosa inkubuje się z komórkami CFBE hodowanymi jako konfluentne monowarstwy na standardowych płytkach do hodowli tkanek. Chociaż bakteria ta jest dość toksyczna dla komórek nabłonkowych, dodatek argininy opóźnia destrukcję monowarstwy na tyle, aby na komórkach CFBE mogły uformować się biofilmy. Druga metoda (nazwana modelem współhodowli biofilmu w komorze przepływowej) obejmuje adaptację aparatury przepływowej do badania biofilmów, często stosowanej w badaniach nad biofilmem, w celu umożliwienia zastosowania szkiełka podstawowego wspierającego konfluentną monowarstwę komórek CFBE. Monowarstwę tę inokuluje się P. aeruginosa, a następnie pompa perystaltyczna tłoczy świeżą pożywkę przez komórki. W obu systemach biofilmy bakteryjne tworzą się w ciągu 6-8 godzin po inokulacji. Wizualizacja biofilmu jest ułatwiona dzięki zastosowaniu szczepów P. aeruginosa konstytutywnie ekspresujących zielone białko fluorescencyjne (GFP). Testy statycznej i przepływowej współhodowli biofilmu stanowią modele wczesnej infekcji płuc w mukowiscydozie (CF) przez P. aeruginosa; techniki te pozwalają na badanie różnych aspektów tworzenia biofilmu i wirulencji P. aeruginosa, w tym cytotoksyczności biofilmu, pomiaru CFU biofilmu oraz barwienia i wizualizacji biofilmu.

Niniejsza praca opisuje różne metody hodowli biofilmu Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórkach nabłonkowych dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) w biofilmie oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Biofilmy bakteryjne wiąże się z szeregiem różnych chorób ludzkich, jednak rozwój biofilmu badano zazwyczaj na nieożywionych...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla biofilmu Pseudomonas aerogen na powierzchni apikalnej żywych ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych. Osiąga się to poprzez uprzednie wytworzenie konfluencyjnej monowarstwy komórek nabłonka dróg oddechowych na powierzchni plastikowej lub szkiełku przedmiotowym. Drugim krokiem procedury jest hodowla kultury bakterii P. aerogen konstytutywnie wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego.Kolejnym krokiem jest doprowadzenie do kontaktu bakterii i komórek dróg oddechowych, albo w warunkach statycznych, albo w komorze przepływowej. Ostatnim etapem procedury jest umożliwienie rozwoju biofilmu bakteryjnego w czasie, przy jednoczesnej ocenie żywotności komórek dróg oddechowych. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można uzyskać wyniki wykazujące tworzenie się biofilmu na żywych komórkach dróg oddechowych.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię pacjentów z mukowiscydozą, ponieważ modele kokultury mogą być wykorzystywane do opracowywania i walidacji nowych schematów antybiotykowych, zdolnych do eliminacji biofilmów odpowiedzialnych za przewlekłą kolonizację dróg oddechowych. W przypadku pacjentów z mukowiscydozą statyczny model biofilmu w kokulturze wykorzystuje komórki CFBE, które są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami nabłonka dróg oddechowych, pochodzącymi pierwotnie od osoby z mukowiscydozą; na siedem do 10 dni przed inokulacją bakteryjną wysiewa się komórki CFBE w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.Komórki wysiewamy w stężeniu 2 × 10⁵ komórek na studzienkę w 0,5 ml minimalnego medium podstawowego (MEM) uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 50 j./ml penicyliny oraz 50 µg/ml streptomycyny. Komórki hodujemy w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ i 95% powietrza przez 7 do 10 dni, wymieniając medium co dwa lub trzy dni.Warunki te doprowadzą do powstania konfluentnej warstwy jednowarstwowej oraz połączeń ścisłych na jeden dzień przed eksperymentem. Zaszczep kulturę 5 ml LB szczepem pierro gen z mrożonego banku i inkubuj przez 18 godzin w temperaturze 37 °C na rotatorze. Przy 200 RPM w dniu inokulacji bakterii stosujemy p aerogen niosący plazmid PSMC 21 w celu konstytutywnej ekspresji GFP.Usunięto medium z komórek CFPE i dodano równą objętość medium do mikroskopii, którym jest MEM bez czerwieni fenolowej, uzupełniony o 2 mM L-glutaminy. Zaszczepiono konfluencyjne monowarstwy CFBE za pomocą posa, stosując wielokrotność infekcji wynoszącą około 30:1 w stosunku do liczby komórek CFBE pierwotnie wysianych na płytkę 24-dołkową. Odpowiada to 1,2 × 10⁷ CFU/ml w 0,5 ml MEM na dołek. Płytkę inkubowano w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza przez jedną godzinę.Po godzinnej inkubacji usunąć supernatant i zastąpić go świeżym podłożem mikroskopowym uzupełnionym o 0,4% argininy. Dodatek argininy opóźnia destrukcję monowarstwy na tyle, aby na komórkach CFPE mogły utworzyć się biofilmy.Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza przez różne okresy czasu, do około ośmiu godzin, wykonując pomiary co dwie godziny. Analizuj integralność monowarstwy CFBE oraz wzrost biofilmu za pomocą mikroskopii. Model biofilmu z kokultury w komorze przepływowej wymaga utworzenia zlewnej monowarstwy komórek CFBE na szklanym szkiełku nakrywkowym o średnicy 40 mm.Aby to osiągnąć, najpierw umieść sterylną szkiełko nakrywkowe w sterylnym plastikowym naczyniu o średnicy 60 milimetrów. Następnie dodaj 3 mL podgrzanej pożywki do wzrostu komórek, dociskając szkiełko końcówką pipety, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione pod spodem i docisnąć szkiełko do dna plastikowego naczynia. Wysiej 2 × 10⁶ komórek CFBE na naczynie. Delikatnie potrząśnij naczyniem w przód i w tył, unikając jednak ruchów wirowych, aby zapobiec odcentrygowaniu komórek do ścianek naczynia.Umieść szalkę w inkubatorze z 5% carbon dioxide i 95% air w temperaturze 37 degrees Celsius na okres od ośmiu do 10 dni. Dokarmiaj komórki co drugi dzień, dodając trzy milliliters świeżej pożywki wzrostowej. W tych warunkach komórki utworzą konfluencyjną monowarstwę na szkiełku podstawowym.Kolejnym krokiem jest przygotowanie szczepu bakteryjnego P aerogen na jeden dzień przed eksperymentem. Hoduj p aerogen w pięciu mililitrach LB przez 18 godzin w temperaturze 37 °C na rotatorze. Przy 200 RPM, w dniu eksperymentu wykorzystujemy szczep P aerogen, PO one, zawierający plazmid PSM C 21 dla konstytutywnej ekspresji GFP.Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej do sterylnej probówki do mikrocentryfugi i wirować z prędkością 6 000 RPM przez trzy minuty. Osad bakteryjny przemyć dwukrotnie w 1 ml medium do mikroskopii. Rozcieńczyć 0,5 ml przemytych i resuspendowanych bakterii w 4,5 ml medium do mikroskopii, aby uzyskać stężenie około 5 × 10⁸ CFU/ml.Teraz możemy przystąpić do obserwacji komórek CFPE w czasie rzeczywistym, co wymaga zastosowania komory obrazującej połączonej z pompą perystaltyczną w celu zapewnienia przepływu składników odżywczych przez dłuższy czas. Wykorzystujemy standardowy aparat do przepływowych komór biofilmowych z regulatorem temperatury. Zastosowano zmodyfikowaną dwukomorową komorę BioTech FCS, dostosowaną do hodowli komórek CFPE.Jednym z najważniejszych etapów w modelu biofilmu w kokulturze w komorze przepływowej jest montaż komory w sposób, który nie uszkodzi monitora komórkowego. Aby zmontować komorę, należy trzymać górną część komory do góry nogami tak, aby rurki perfuzyjne były widoczne, a następnie dopasować otwory prześwitowe gumowej uszczelki o grubości 0,75 mm do rurek perfuzyjnych. Na gumowej uszczelce należy umieścić dostarczony do komory slajd mikroakweduktu, upewniając się, że strona z rowkami jest skierowana do góry.Następnie umieść kolejną gumową uszczelkę na wierzchu szkiełka. Grubość i geometria wewnętrzna tej drugiej uszczelki określą objętość komory. Następnie nanieś jeden mililitr uprzednio ogrzanego medium mikroskopowego na środek szkiełka.Umieść komorę obrazującą na sterylnej powierzchni, a następnie wyjmij komórki CFPE z inkubatora do hodowli komórkowych. Usuń zużyte medium z naczynia i wypłucz komórki CFPE raz, używając 3 mL uprzednio ogrzanego medium do mikroskopii. Użyj pęsety przemytej etanolem.Wyjmij szkiełko nakrywki z naczynia i opuść je odwrócone stroną górną do dołu na kroplę medium do mikroskopii umieszczoną na komorze. Szkiełko nakrywki spoczywa teraz na drugiej uszczelce gumowej, a monowarstwa komórek dróg oddechowych jest skierowana w dół. Trzymając zmontowane komponenty w jednej ręce, umieść podstawę komory na górze stosu i szybko obróć komorę, tak aby wszystko znalazło się w pozycji prawidłowej.Zablokuj podstawę, przekręcając pierścień. Podłącz rurkę doprowadzającą do mikropompy perfuzyjnej o niskim przepływie. Druga rurka łączy pompę z kolbą zawierającą medium do mikroskopii, umieszczoną w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Znajduje się bezpośrednio obok mikroskopu. Rozpocznij przepływ z prędkością 20 milliliters per hour. Ta prędkość przepływu mieści się w zakresie prędkości pływania posa.Przymocuj sterylną, dociętą rurkę CFL o średnicy 1/16 cala do rurek doprowadzających i odprowadzających perfuzję komory, a następnie podłącz kontroler temperatury. Umieść zmontowaną komorę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml.Wstrzyknij wcześniej przygotowaną zawiesinę bakteryjną do komory, używając zaworu dwudrożnego umieszczonego w linii między pompą a komorą, aby umożliwić bakteriom przyczepienie się do komórek dróg oddechowych. Zatrzymaj pompę na dwie godziny. Po dwóch godzinach można ponownie uruchomić przepływ i utrzymywać go na poziomie 20 milliliters per hour.W dalszej części eksperymentu monitoruj integralność komórek dróg oddechowych za pomocą mikroskopii kontrastowej z interferencją różnicową, aby sprawdzić, czy nie pojawiły się oznaki uszkodzenia monowarstwy. Równocześnie obserwuj rozwój biofilmów p aerogen znakowanych GFP na powierzchni apikalnej komórek dróg oddechowych.Dzięki pozyskaniu obrazów za pomocą odwróconego konfokalnego lub szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego zarówno w testach statycznych, jak i w komorach przepływowych, stwierdzono, że monowarstwa CFPE była w stanie wytrzymać obecność p aerogen przez maksymalnie osiem godzin po inokulacji bez żadnych oznak zmian. Integralność monowarstwy nabłonka można ocenić za pomocą mikroskopii fazokontrastowej z użyciem mikroskopu odwróconego, co pokazuje ten przykład konfluencyjnej monowarstwy komórek CFPE hodowanych na płytkach do hodowli tkankowej. Z czasem p aerogen będzie produkować toksyny i czynniki wirulencji, które mogą w pełni lub częściowo uszkodzić monowarstwę komórek nabłonka.Na tym przykładzie uszkodzonej warstwy jednowarstwowej CFPE widać bakterie P. aerogenes (zaznaczone na zielono), które rozprzestrzeniają się między połączeniami ścisłymi komórek nabłonkowych i uzyskują dostęp do błon bazolateralnych. W takich warunkach zazwyczaj nie dochodzi do tworzenia biofilmu ze względu na degradację monowarstwy. Przedstawiony obraz ukazuje przerośnięty biofilm P. aerogenes zaobserwowany 24 godziny po inokulacji, po pomyślnym utrzymaniu procesu tworzenia biofilmu.Monowarstwa CFPE została uszkodzona nieodwracalnie i obecnie jest praktycznie nieobecna. Przedstawiono pozostały biofilm rosnący w postaci płaskiej warstwy bakterii przylegającej do szklanego szkiełka podstawowego. W przypadku braku naruszenia integralności monowarstwy dróg oddechowych.Biofilmy P aerogen mogą z powodzeniem tworzyć się i rozwijać na powierzchni apikalnej komórek dróg oddechowych w obu modelach kokultury. Przedstawiony tutaj obraz jest reprezentacyjnym zdjęciem biofilmu P aerogen wykazującego ekspresję GFP, wyhodowanego na konfluencyjnej monowarstwie komórek CFPE z wykorzystaniem statycznego modelu biofilmu kokultury, ocenionego za pomocą mikroskopii epi-fluorescencyjnej. Obraz stanowi nałożenie kanału kontrastu fazowego i kanału fluorescencyjnego.Kolejny obraz przedstawia p aerogen znakowany GFP. Biofilm hodowany przez sześć godzin na konfluencyjnej monowarstwie komórek CFBE z wykorzystaniem modelu współhodowli biofilmu w komorze przepływowej w celu ułatwienia wizualizacji dróg oddechowych. Jądra komórkowe monowarstwy zostały zabarwione HEXT 3 33 42 przed inokulacją posa i mają kolor niebieski.Błony prezentujące się jako zielone grudki przyczepione do powierzchni apikalnej komórek CFPE są rozproszone pomiędzy komórkami dróg oddechowych. Tutaj przedstawiono typowe struktury przypominające grzyby w biofilmach Aerogen sześciogodzinnych formujących się na monowarstwie komórek A-C-F-P-E po rekonstrukcji 3D. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak skutecznie hodować i wizualizować biofilmy bakteryjne na ustalonej monowarstwie komórek dróg oddechowych przy użyciu opisanych tutaj modeli kokultury w połączeniu ze standardowymi metodami mikrobiologicznymi i mikroskopią fluorescencyjną.

co-culture-models-pseudomonas-aeruginosa-biofilms-grown-on-live-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Modele współhodowli biofilmów Pseudomonas aeruginosa rosnących na żywych komórkach ludzkich dróg oddechowych

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

To badanie nakreśla ramy dla rozwoju modelu zagregowanego biofilmu wielomikrobiologicznego i optymalizacji protokołu ekstrakcji RNA w celu oceny ekspresji genu Pseudomonas aeruginosa odzwierciedlającej środowisko płuc mukowiscydozy. Zastosowania obejmują ocenę działania przeciwdrobnoustrojowego i badanie alternatyw dla antybiotyków w warunkach istotnych dla mukowiscydozy.

Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Poznaj metody hodowli biofilmów Pseudomonas aeruginosa na żywych ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych. Technika ta umożliwia wizualizację fluorescencyjną i ocenę cytotoksyczności, wspierając badania nad zakażeniami oddechowymi.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Przeglądaj więcej filmów