Modele kohodowli biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych ludzkich komórkach dróg oddechowych

Ten artykuł opisuje różne metody hodowli biofilmów Pseudomonas aeruginosa na hodowanych ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) biofilmu oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie biofilmów aerogenowych Pseudomonas na powierzchni wierzchołkowej żywych komórek nabłonka dróg oddechowych człowieka. Osiąga się to poprzez najpierw ustanowienie zlewającej się monowarstwy komórek nabłonka dróg oddechowych na plastikowej powierzchni lub szklanym szkiełku nakrywkowym. Drugim etapem zabiegu jest wyhodowanie kultury bakterii p aerogenowych w sposób konstytutywny, wykazujący ekspresję białka zielonej fluorescencji.

Następnym krokiem jest umieszczenie bakterii i komórek dróg oddechowych w kontakcie ze sobą w warunkach statycznych lub w komorze przepływowej. Ostatnim etapem procedury jest umożliwienie rozwoju biofilmów bakteryjnych w czasie, przy jednoczesnej ocenie żywotności komórek dróg oddechowych. Wyniki pokazujące tworzenie się biofilmu na żywych komórkach dróg oddechowych można uzyskać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię pacjentów z mukowiscydozą, ponieważ te modele kokultury mogą być wykorzystywane do opracowywania i walidacji nowych schematów antybiotykowych, zdolnych do eliminowania biofilmów odpowiedzialnych za przewlekłą kolonizację dróg oddechowych. U pacjentów z mukowiscydozą statyczny model biofilmu kohodowlanego wykorzystuje komórki CFBE, które są unieśmiertelnionymi ludzkimi drogami oddechowymi. Komórki nabłonkowe pierwotnie wytworzone od osoby z mukowiscydozą od siedmiu do 10 dni przed inokulacją bakteryjną umieszczają komórki CFBE na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Wysiewamy komórki w stężeniu dwa razy od 10 do piątych komórek na studzienkę w 0,5 mililitra minimalnej niezbędnej pożywki lub MEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą dwumilimolową L-glutaminą, 50 jednostkami na mililitr, penicyliną i 50 mikrogramami na mililitr. Streptomycyna hoduje komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. 95%AIR przez siedem do 10 dni zmienia podłoże co dwa do trzech dni.

Warunki te doprowadzą do powstania zlewających się, jednowarstwowych i ścisłych połączeń na dzień przed eksperymentem. Zaszczep pięciomililitrową kulturę LB pierro gen z zamrożonego wywaru i hoduj 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza na rotatorze. Przy 200 obr./min używamy aerogenu p przenoszącego plazmid PSMC 21 do konstytutywnej ekspresji GFP w dniu inokulacji bakteryjnej.

Usuń pożywkę z komórek CFPE i dodaj równą objętość pożywki mikroskopowej, która jest MEM bez czerwieni fenolowej, uzupełniona dwumilimolową konfluencją inokulatu L-glutaminy, monowarstwy CFBE z posa przy wielokrotności infekcji około 30 do jednego w stosunku do liczby komórek CFBE pierwotnie wysianych na płytkę 24-dołkową. Odpowiada to 1,2 razy 10 siódmego CFU na mililitr w 0,5 mililitra MEM na. Dobrze inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, 95% powietrza przez godzinę.

Po godzinnej inkubacji usunąć snat i zastąpić go świeżym mikroskopem. Pożywka uzupełniona 0,4% argininą. Dodatek argininy opóźnia zniszczenie monowarstwy na tyle długo, aby na komórkach CFPE utworzyły się biofilmy.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, 95% powietrza przez różne punkty czasowe do około ośmiu godzin co kilka godzin. Przeanalizuj integralność monowarstwy CFBE i wzrost biofilmu za pomocą mikroskopii. Model biofilmu kohodowli komórek przepływowych wymaga utworzenia zlewającej się monowarstwy komórek CFBE na szklanym szkiełku nakrywkowym o średnicy 40 milimetrów.

Aby to osiągnąć, należy umieścić sterylną nakrywkę w sterylnym plastikowym naczyniu o średnicy 60 milimetrów. Następnie dodaj trzy mililitry wstępnie podgrzanego wzrostu komórek, średnio naciskając końcówką pipety na szkiełko nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki uwięzione pod spodem i wepchnąć szkiełko nakrywkowe na dno nasion plastikowego naczynia, dwa razy po 10 do szóstych komórek CFBE na szalkę. Delikatnie potrząśnij naczyniem w przód iw tył, ale unikaj wirowania, aby zapobiec odwirowaniu komórek na bokach naczynia.

Umieść naczynie w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem w temperaturze 37 stopni Celsjusza na osiem do 10 dni. Karm komórki co drugi dzień trzema mililitrami świeżej pożywki wzrostowej. W tych warunkach komórki utworzą zlewającą się monowarstwę na szklanym szkiełku nakrywkowym.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie szczepu bakterii P aerogen na dzień przed eksperymentem. Hoduj p aerogen w pięciu mililitrach LB przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza na rotatorze. Przy 200 obr./min używamy szczepu aerogenowego P, PO jeden, przenoszącego plazmid PSM C 21 do konstytutywnej ekspresji GFP w dniu eksperymentu.

Na jeden mililitr kultury bakteryjnej do sterylnej mikroprobówki wirówkowej i wirować z prędkością 6 000 obr./min przez trzy minuty. Umyj osad bakteryjny dwukrotnie w jednym mililitrze mikroskopu. Podłoże rozcieńczyć 0,5 mililitra umytych i ponownie zawieszonych bakterii w 4,5 mililitra pożywki mikroskopowej, aby osiągnąć stężenie około pięć razy 10 ósmych CFU na mililitr.

Teraz jesteśmy gotowi do obserwacji komórek CFPE w czasie rzeczywistym, co wymaga komory obrazowania sprzężonej z pompą perystaltyczną, aby zapewnić przepływ składników odżywczych przez dłuższy czas. A regulator temperatury używamy standardowego aparatu do pomiaru przepływu biofilmu. Dwukomorowy FCS firmy biotechnologicznej zmodyfikowany tak, aby pomieścić komórki CFPE.

Jednym z najbardziej krytycznych etapów w modelu biofilmu kokultury komórek przepływowych jest montaż komory bez uszkodzenia monitora komórki W celu zmontowania komory. Przytrzymaj górną połowę komory do góry nogami, tak aby rurki perfuzyjne były widoczne i wyrównaj otwory luzu gumowej uszczelki o grubości 0.75 milimetra na rurkach perfuzyjnych. Ułóż zjeżdżalnię mikroakweduktu dostarczoną z komorą na uszczelce gumowej, upewniając się, że rowkowana strona jest skierowana do góry.

Następnie umieść kolejną gumową uszczelkę na górze prowadnicy. Grubość i geometria wewnętrzna tej drugiej uszczelki określi objętość komory. Następnie dodaj jeden mililitr wstępnie ciepłej pożywki mikroskopowej na środku szkiełka.

Umieść komorę obrazowania na sterylnej powierzchni podczas pobierania komórek CFPE z inkubatora do hodowli komórkowych. Usuń zużytą pożywkę z naczynia i umyj komórki CFPE raz trzema mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki mikroskopowej. Za pomocą kleszczy mytych etanolem.

Wyjmij szkiełko nakrywkowe z naczynia i opuść je do góry nogami na kulkę pożywki mikroskopowej umieszczoną w komorze. Szkiełko nakrywkowe spoczywa teraz na drugiej gumowej uszczelce, a monowarstwa komórek dróg oddechowych jest skierowana w dół. Trzymając zmontowane elementy w jednej ręce, umieść podstawę komory na szczycie stosu i szybko odwróć komorę, aby wszystko było prawą stroną do góry.

Zablokuj podstawę na miejscu, obracając pierścień. Podłącz rurkę wlotową do pompy mikroperfuzyjnej o niskim przepływie. Drugi kawałek rurki łączy pompę z blaszkami pożywki mikroskopowej umieszczonej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Znajduje się tuż obok mikroskopu. Rozpocznij przepływ z szybkością 20 mililitrów na godzinę. To natężenie przepływu mieści się w zakresie prędkości pływania posa.

Podłącz sterylną, wstępnie przyciętą jedną rurkę 16th CFL do wlotowych i wylotowych rurek perfuzyjnych komory, a następnie podłącz regulator temperatury. Umieść zmontowaną komorę na stoliku mikroskopu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności jednego mililitra.

Preparat wcześniej przygotowany zawiesinę bakteryjną należy wstrzyknąć do komory za pomocą zaworu dwudrogowego umieszczonego w linii między pompą a komorą, aby umożliwić bakteriom przyczepienie się do komórek dróg oddechowych. Zatrzymaj pompę na dwie godziny. Po dwóch godzinach przepływ można ponownie zainicjować i utrzymać na poziomie 20 mililitrów na godzinę.

Przez pozostałą część eksperymentu monitoruj integralność komórek dróg oddechowych poprzez interferencję różnicową. Mikroskopia kontrastowa przez cały czas trwania eksperymentu, aby sprawdzić, czy nie ma oznak uszkodzenia monowarstwy. Równolegle obserwuje się rozwój biofilmów aerogenowych p znakowanych GFP na wierzchołkowej powierzchni komórek dróg oddechowych.

Uzyskując obrazy za pomocą odwróconego konfokalnego lub szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego zarówno w testach statycznych, jak i przepływowych, stwierdzono, że monowarstwa CFPE może wytrzymać obecność aerogenu p przez okres do ośmiu godzin po inokulacji bez żadnych oznak zmian. Integralność jednowarstwowej warstwy nabłonka można ocenić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy użyciu odwróconej, jak pokazano w tym przykładzie zlewającej się monowarstwy komórek CFPE hodowanych na płytkach do hodowli tkankowych. Z biegiem czasu p aerogen będzie wytwarzał toksyny i czynniki wirulencji, które mogą całkowicie lub w sekcjach uszkodzić monowarstwę komórek nabłonka.

W tym przykładzie naruszonej monowarstwy CFPE, bakterie aerogenowe P pokazane na zielono rozprzestrzeniają się między ścisłymi połączeniami komórek nabłonkowych i uzyskują dostęp do błon podstawno-bocznych. Tworzenie biofilmu zazwyczaj nie jest osiągane w tych warunkach ze względu na niszczenie monowarstwy. To zdjęcie pokazuje przerośnięty biofilm aerogenowy p obserwowany 24 godziny po inokulacji po pomyślnym wsparciu tworzenia biofilmu.

Monowarstwa CFPE została uszkodzona nie do naprawienia i obecnie praktycznie jej nie ma. Pokazano resztkowy biofilm rosnący jako płaska warstwa bakterii przyczepiony do szkiełka nakrywkowego. Gdy integralność monowarstwy dróg oddechowych nie jest naruszona.

Biofilmy aerogenowe P mogą z powodzeniem tworzyć się i rozwijać na wierzchołkowej powierzchni komórek dróg oddechowych w obu modelach kohodowli. Pokazano tutaj reprezentatywny obraz biofilmu aerogenowego A z ekspresją GFP wyhodowanego na zlewającej się monowarstwie komórek CFPE przy użyciu statycznego modelu biofilmu kokulturowego ocenianego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epi. Obraz jest nakładką kanału kontrastowego twarzy i kanału fluorescencji.

Następny obraz przedstawia A GFP oznaczony p aerogen. Biofilm hodowany przez sześć godzin na zlewającej się monowarstwie komórek CFBE przy użyciu modelu biofilmu kohodowli komórek przepływowych w celu ułatwienia wizualizacji dróg oddechowych. Jądra jednowarstwowe zostały wybarwione HEXT 3 33 42 przed inokulacją posa i mają niebieski kolor.

Folie przedstawiające się jako zielone grudki przyczepione do wierzchołkowej powierzchni komórek CFPE są rozpraszane w komórkach dróg oddechowych. Pokazano tutaj typowe struktury przypominające grzyby sześciogodzinnych biofilmów aerogenowych tworzących się na monowarstwie komórek A-C-F-P-E po rekonstrukcji 3D. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie hodować i wizualizować biofilmy bakteryjne na ustalonej monowarstwie komórek dróg oddechowych przy użyciu opisanych tutaj modeli kohodowli i sprzężonych ze standardowymi metodami mikrobiologicznymi i mikroskopią fluorescencyjną.