Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

Ja jestem tobą. Pracuję w laboratorium Antona Jamesa. Dzisiaj pokażę wam, jak wykonać mikroiniekcję do zarodków ADI w Egipcie w celu uzyskania transgenicznych komarów.

Aby uzyskać zarodki do mikroiniekcji, musimy karmić samice krwią. Samice mają być karmione w czwartek. Jeśli chcesz zrobić mikrozastrzyk od poniedziałku do piątku, to też jest podłe.

Biorę bawełnę, wkładam i nalewam wodę. Bawełna powinna być mokra i wziąć trzy mm białe koło, położyć na wierzchu i docisnąć. I muszę wlać wodę, wyczyścić dach, serwetkę i zamknąć bawełną.

To jest gotowe W tej chwili zamierzam zebrać sześć 10 samic i przenoszę samice do wycofania się na krótką chwilę, a następnie zamierzam umieścić je w ciemnych warunkach i umieścić w komorze, która ma seledyn o temperaturze 27 stopni na godzinę i 15 minut. Robię igły do mikroiniekcji za pomocą szklanych igieł, a my używamy polar shuttle instrument corporation i model P 87. Wkładam szklaną igłę do pierścienia i mocuję z obu stron.

Zamknij pokrywę, a igła wciskająca jest czerwona. Teraz pokażę ci, jak to zrobić z igłami. Igły po wyciągnięciu są zamykane i musimy ponownie je otworzyć.

Można to zrobić na dwa sposoby. Jednym ze sposobów jest połączenie, a innym sposobem jest dotknięcie zarodka przed wstrzyknięciem. Okej, to jest sposób Lin.

Mam igłę i naprawiam tę igłę tutaj. Oto un nad końcówką, której nie możemy użyć do mikroiniekcji. Ta końcówka do mikroiniekcji musi mieć otwartą końcówkę.

To jest koło. Staram się dotknąć igłą powierzchni koła, a końcówki igieł muszą dotykać powierzchni koła. Gdy końcówka dotknie powierzchni, musisz założyć koło.

Tutaj widać, że igła jest gotowa do mikroiniekcji. Końcówka igły jest w kształcie litery be i widać, że końcówka świeci. Oznacza to, że igła jest otwarta i gotowa do mikroiniekcji.

Pamiętaj, że tylko koniec rurki musi być złamany. Jeśli zrobisz dużą dziurę, igła nie jest dobra. Otwór musi być bardzo mały.

Minęła godzina i 15 minut, a zarodki powinny być gotowe do mikroiniekcji, które biorę z komory. Daj sobie chwilę i zobaczysz zarodki, czarną dawkę na papierze, a teraz przenoszę samice do klatki. Po prostu pozwól im wlecieć.

Teraz pokażę wam narzędzia, których zamierzam użyć do wyrównania zarodków. To siły, których używam, aby zabrać papier X z natury. To siły, których używam do zrobienia linii zarodka.

Cezar, musimy przeciąć podwójną taśmę klejącą i te siły używam do wyjmowania jaj po mikro iniekcjach. To jest szkiełko nakrywkowe. Do tego szkiełka nakrywkowego.

Przyczepiam podwójną taśmę klejącą, aby pobrać zarodki z papieru watmana. Teraz zamierzam wyrównać zarodki. Na pierwszy zabieram papier X z tego czasu.

Trzeba pamiętać, że papier cały czas musi być mokry. Zamierzam wyłożyć zarodki od szarego do ciemnoszarego. Jest to dobry etap do wstrzykiwań.

Nie bierz białych i czarnych zarodków, wszystkie zarodki muszą być w tej samej orientacji. Mamy dwa bieguny, Ontario i plakat, który zamierzamy wstrzyknąć w Posterial.End. Strona Ontario jest nieco szersza niż tylna.

To jest szkiełko nakrywkowe. Zamierzam zrobić szkiełko nakrywkowe, gotowe do pobrania zarodków. Do tego potrzebuję podwójnej taśmy klejącej przymocowanej do okładki.

Poślizg, cięcie, starzenie i szkiełko nakrywkowe jest gotowe. W tej chwili muszę bardzo dobrze wysuszyć papier X, ponieważ jeśli zarodki są mokre, nigdy nie przyklejają się do taśmy. W tym celu używam suchego MV. W tej chwili biorę szkiełko nakrywkowe i podwójną taśmę do steków i bardzo lekko dociskam do zarodków.

A na szkiełku nakrywkowym mam zarodki. I w tej chwili jest ten krok w kierunku selekcji. Ten krok dykcji będzie musiał poczekać w tej pozycji około minuty może.

Ale wystarczy spojrzeć pod mikroskopem i zobaczyć, że jaja zaczynają się kurczyć. Te zarodki są wysuszone. Możesz zobaczyć wgłębienia, a kiedy zobaczysz te wgłębienia, musisz natychmiast wlać olej i przestać wysychać.

Kiedy zarodki są wysuszone, należy natychmiast wlać olej. Zarodki są gotowe do mikroiniekcji. Wprowadzam na scenę zarodki liniowe i zamierzam wypełnić igły, DNA do tego. Używam rury dołączającej i igły ładującej również z dołączania stąd.

A ja biorę moje DNA biorąc 1,5 mikrolitra. Dobra i załaduj, a igła i ja przymocowaliśmy igłę do uchwytu. A hol jest podłączony do mikrowtryskiwacza.

Używamy mikrowtryskiwaczy einor, które nazywają się Femto jet. Teraz jestem gotowa do wstrzyknięcia zarodków. W przypadku tych papierów używamy ciśnienia wtrysku 600, ciśnienia wstecznego 250, a czas jest ręczny.

W tej chwili widzę bardzo doskonałe zarodki pod mikroskopem. A potem wprowadzam igłę, a także muszę bardzo dokładnie widzieć i ustawić ostrość igły w mikroskopie. Następnie umieszczam z powrotem zarodki i mogę zobaczyć zarodki i igłę na tym samym polu.

I teraz przymocuj igłę bardzo blisko tylnego końca zarodków. Robię zastrzyk do tylnego końca zarodków. I najpierw to, co robię, najpierw muszę zobaczyć bardzo wyraźne zarodki pod mikroskopem.

Przesuwam stolik mikroskopu i zawsze widzę, gdzie igła się nie porusza. Dobry wtrysk. Idealny zastrzyk.

Kiedy widzisz tylny koniec i docierasz do igły, dotykasz tylnej części i penetrujesz ją i nie widzisz żadnego skurczu X, żadnego skurczu w ten sposób. Jeśli ci się to podoba, to nie jest zbyt dobrze. Ale jeśli x nadal znajduje się w takiej pozycji i penetrujesz igłę, oznacza to, że twoja igła jest bardzo dobra, a wstrzyknięcie jest bardzo dobre.

Po mikroiniekcji muszę przenieść EMRE w wilgotnych warunkach. Do tego używam plastikowej komory z mokrą bawełną na dnie i mokrym papierem. Kładę to na bawełnie i upewniam się, że ten papier jest mokry.

To jest gotowe. Biorę swoją siłę. Uczę zarodki pod olejem i kładę na ścianie na papierze.

Proszę, nie kładź na dnie, ponieważ olej musi zejść z zarodka, a ja, biorę 2, 3, 5 zarodków za jednym razem lub jeden, to też jest w porządku. Teraz zamierzam przygotować zarodki, aby były gotowe do insektacji. W tym celu biorę chusteczkę krewniaczą, przykrywam zarodki i mocuję gumą.

A to jest gotowe na owada przez pięć dni. Następnie trzymamy w Inspekcji przez pięć dni, a potem wyklujemy się z zarodka, ech, i dostaniemy transgeniki. Teraz jestem na elektrowstrząsach i pokażę wam, jak uzyskać zarodki.

A najpierw wleję wodę do plastikowej komory i dodam jedzenie. Kilka kropli, weź zarodki, które pozostają w insektorowym pokarmie przez pięć dni. Weź papier jajeczny, zrób mały otwór i połóż zarodki.

Otóż to. Zarodki zaczynają się wykluwać po pierwszym w pierwszym tygodniu. A także niektóre zarodki zaczynają się wykluwać po czterech tygodniach.

I zawsze mamy w piasku, różne stadia larw i pu, po prostu mam dla was pokazanie, jak zrobić mikroiniekcję do zarodków dete. Chcę powiedzieć, że trzy kroki są bardzo ważne w tej procedurze. Musisz zrobić bardzo dobre igły.

Musisz pobrać zarodki w odpowiednim etapie. Osuszanie musi być również wykonane bardzo precyzyjnie, nie za dużo. Za około cztery tygodnie będziemy mieli transgeniczne komary.