Protokół dotyczący zakażeń dengą u komarów (A. aegypti) i oznaczanie fenotypu infekcji

Nazywam się George Dimopoulos, a teraz pokażemy Ci procedurę, jak zarazić komara Aidas GTI wirusem dengi. Pierwszą rzeczą, którą musimy zrobić, to rozmnożyć wirusa w linii komórkowej Aidas Aus. Nazywam się José Luis Ramirez i jestem doktorantem w Laboratorium Uniwersyteckim.

Do tej procedury będziemy potrzebować placówki BSL two z kapturem do hodowli tkankowych, inkubatora CO2 ustawionego na 37 stopni Celsjusza. Potrzebujemy plastikowych probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Potrzebujemy ludzkiej surowicy, potrzebujemy kąpieli wodnej, 37 stopni Celsjusza, wirówki.

Potrzebujemy 96-dołkowych płytek i innych standardowych biologii molekularnej i biochemii, odczynników i materiałów eksploatacyjnych. Jest to więc zwykły kaptur do hodowli tkankowej w dwóch obiektach BSL, a pierwszym krokiem jest wyjęcie komórek, które osiągnęły płynność 80% CO, w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Jest to pożywka MEM z 10% ciepłem, ciepłem i aktywowaną płodową surowicą bydlęcą uzupełnioną o 1% L-glutaminę i aminokwasy endogenne.

Okej, teraz dodamy wirusa dengi do komórek. Wyjęliśmy zapas wirusa z zamrażarki minus 80 i rozmroziliśmy go w inkubatorze o temperaturze 37 stopni. Dodajemy do komórek około 0,5 mililitra podstawowego wirusa, aby osiągnąć stężenie około 1,5 cząsteczki wirusa na komórkę.

Komórki są następnie umieszczane na wytrząsarce na około 15 minut z powolną szybkością wstrząsania. Następnie komórki umieszcza się w inkubatorze CO2 na około 45 minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza stężenie CO2 wynosi 5%Po 45 minutowej inkubacji wyjmujemy komórki i dodajemy 30 ml pożywki, a następnie ponownie umieszczamy komórki w inkubatorze i inkubujemy przez kolejne pięć dni.

Teraz przygotujemy cząsteczki wirusa do infekcji. Najpierw musimy oderwać komórki od kolby za pomocą skrobaka, a następnie przenieść je wraz z pożywką do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Teraz mamy komory wirówki o prędkości 12 000 obr./min przez 10 minut, aby je granulować.

Na dnie tej butelki widać granulkę. Następnie usuniemy supernatant i pozostawimy tylko jeden ml w komórkach, aby uwolnić wirusa z komórek. Zamrozimy je.

Spowoduje to pęknięcie komórek, a następnie rozmrozimy je, a następnie ponownie zamrozimy i powtórzymy tę procedurę trzy do czterech razy, a zamrażanie odbywa się na suchym lodzie. Po zamrożeniu granulki komórek umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni, aby je rozmrozić, a następnie ponownie zamraża się je na suchych oczach między każdym etapem zamrażania, WEP zawiesza komórki poprzez wirowanie. Teraz zbieramy wirusa zawierającego supernatant i dodajemy go do supernatantu z poprzedniego wirowania, który również zawiera cząsteczki wirusa.

Ten preparat wirusowy jest teraz gotowy do połączenia z równą ilością pełnej krwi ludzkiej i surowicy. Tutaj połączyliśmy preparat wirusa z pełną ludzką krwią uzupełnioną 15% ludzką surowicą. Ten roztwór wirusa krwi będzie teraz używany do karmienia komarów i zarażania ich.

Dodamy tę krew do karmnika membranowego, a ten podajnik membranowy zostanie umieszczony na kubku zawierającym komary i pozwolimy komarom żywić się tą krwią przez około 25 minut. Na podajniku membranowym umieściliśmy klips w celu jego stabilizacji. Obciąża go w zasadzie na siatce, a teraz dodamy krew do podajnika.

W niektórych przypadkach ten eksperyment może działać lepiej, gdy jest wykonywany w ciemności, ponieważ naturalnie komary często żerują w ciemności. Zależy to oczywiście od tego, jak kolonia komarów została uwarunkowana. Komary żerowały już przez około 25 do 30 minut, a my możemy wyjąć karmnik membranowy i umieścić go w bezpiecznym pojemniku w celu odkażenia.

Po dopasowaniu krwi niezdolne do pracy komary muszą zostać usunięte z komarów karmionych. Aby to zrobić, powaliliśmy komary, umieszczając małe kubki zawierające komary karmione krwią w zimnym pomieszczeniu na pięć do 10 minut. Jak widać, komary są już na mrozie.

Otwieramy pokrywę i przenosimy komary do małego naczynia na benzynę, które jest trzymane na wiaderku z lodem, aby komary były przez cały czas trzymane w chłodzie i nie mogły uciec. Pamiętaj, że są to zakażone komary, więc należy zachować ostrożność, aby nie puścić ich luzem. Gdy komary znajdą się w zimnym pomieszczeniu, które przenosi komary do normalnego sektora, który jest utrzymywany w temperaturze pokojowej, ale zawsze umieszczamy komary w naczyniu na petro, które jest trzymane w wiadrze z lodem, więc są tam, aby zawsze były na dole.

Możesz zobaczyć, jak komary Fed mogą zostać usunięte z tych UNFI. Te Fed mają w sobie krew. Są w pełni nabrzmiałe.

Niektóre z nich żywiły się częściowo krwią, więc nie są w pełni nabrzmiałe. Mają trochę krwi w brzuchu, ale inni mają dużo krwi w brzuchu. Ci z UNFI nie mają krwi w brzuchu, więc można łatwo, łatwo odróżnić Feda od tych nieprzystosowanych.

Więc przeniesiemy te komary z naczynia na benzynę na kartonowe kubki z linii wosku. Następnym krokiem jest oznaczenie zakażenia wirusem dengi u komara. Jeśli chcemy zbadać infekcję wirusową w jelicie środkowym komara, powinniśmy przeprowadzić sekcję komarów około siódmego dnia po spożyciu posiłku z krwi.

A jeśli chcesz przetestować infekcję wirusową w gruczole sali, powinniśmy przeprowadzić sekcję komarów około 14 dni po karmieniu krwią, Jose pokaże ci teraz, jak wyciąć jelito od komara. Komary zostały teraz znieczulone na lodzie, a my zabijemy je poprzez inkubację w 70% etanolu przez około minutę. Następnie przenosimy komary do dwóch kolejnych kąpieli wodnych.

Po jednej minucie. Ma to na celu zmycie etanolu z komarów. Teraz przeanalizujemy komary w PBS na szkiełkach mikroskopowych.

Najlepszym sposobem na wypreparowanie jelita środkowego od komara czasu gipsowego jest ułożenie komara do góry nogami na skrzydłach i złapanie części brzusznej jednym kleskiem, a klatki piersiowej drugim kleszczem, a następnie pociągnięcie komara. Teraz Jose rozrywa komara, a jelito pojawi się między brzuchem a piersiową częścią komara. Teraz jelito to półprzezroczysta tkanka, która pojawiła się w górnej części komara.

Teraz przeniesiemy wypreparowane jelito do pożywki linii komórkowej i przeniesiemy je do okapu do hodowli tkankowej, aby wyizolować cząsteczki wirusa z jelita. Przenosimy wypreparowane jelita środkowe do pomieszczenia do hodowli tkankowej i homogenizujemy za pomocą tłuczka, aby uwolnić cząsteczki wirusa. Po homogenizacji jelita środkowego dodajemy pożywkę do homogenatu, aby uzyskać rozcieńczenie cząsteczek wirusa od 1 do 100.

Następnie kontynuujemy rozcieńczanie tego dalej do jednego do 10, jednego do 101 do 1000. Na płytce 96-dołkowej przygotowaliśmy linię komórkową Alba picto do 80% płynności co w płytce 24-dołkowej. Następnie usuwamy sup natant z komórek picto rozworu rozworu białego i do tych komórek dodajemy rozcieńczone cząsteczki wirusa w celu określenia stężenia cząstek wirusa w każdym rozcieńczeniu.

Pozwoli nam to określić poziom infekcji wirusem. W jelicie środkowym komara komórki są następnie powoli wstrząsane przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieszczamy komórki na 45 minut w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 stopni.

Następnie dodajemy jeden ml 1% nakładki metylocelulozy do każdej studzienki, a następnie płytkę ponownie inkubuje się w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 stopni przez pięć dni. Po pięciodniowej inkubacji dodajemy jeden ml utrwalacza acetonowo-metanolowego do każdej studzienki. Następnie inkubujemy płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce przez godzinę.

Następnie usuwamy utrwalacz i myjemy każdą studzienkę jeden raz PBS. Następnie wykonujemy rozcieńczenie 1 do 1000 pierwszorzędowego przeciwciała przeciw dendze w 5% roztworze krwi. Następnie dodajemy 200 mikrolitrów tego roztworu przeciwciał.

Do każdego, cóż, poruszaj głową. Dzięki. Następnie inkubujemy płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie usuwamy płyn hiperimmunologiczny i myjemy każdy dobrze jednym XPBS.

Następnie powtarzamy procedurę dokładnie w ten sam sposób z przeciwciałem drugorzędowym. Przygotowuje się 20 ml substratu zgodnie z protokołem i dodajemy go do pojemnika. Następnie do każdej studzienki dodajemy 200 mikrolitrów podłoża

Następnie zatrzymujemy reakcję, usuwając podłoże i dodajemy po jednym ml wody destylowanej do każdej studzienki. Następnie wylewamy wodę z talerza i pozostawiamy talerz do wyschnięcia. Każda kolorowa kropka reprezentuje płytkę wirusów, a licząc te płytki, możemy oszacować liczbę cząsteczek wirusa, które znajdowały się w pierwotnym jelicie środkowym komara, którego homogenizowaliśmy.

Właśnie pokazaliśmy Ci procedurę, jak przeprowadzić infekcję wirusem dengi u komarów aegypti. Protokół ten polega na produkcji wirusa w linii komórkowej komara. Cząsteczki wirusa są następnie oczyszczane z linii komórkowej i izolowane, a następnie mieszane z ludzką krwią pełną i podawane komarom.

Wirus zainfekuje komary, a po ustaleniu infekcji pokazaliśmy, jak wyizolować tkankę jelita środkowego komara i jak określić poziom infekcji tego jelita środkowego. Zasadniczo homogenizujemy jelito środkowe i używamy tej procedury do uwolnienia cząsteczek wirusa z tego jelita środkowego. Następnie używamy tych cząsteczek wirusa do ponownego zakażenia linii komórkowej komara w celu określenia poziomu infekcji jelita środkowego, liczby cząsteczek wirusa, które zainfekowały jelito komara.