Name: Protokół dotyczący zakażeń dengą u komarów (A. aegypti) i oznaczanie fenotypu infekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Poznaj metodę zakażenia komarów Aedes aegypti wirusem dengi w celu badania genów odpowiedzialnych za odporność na infekcję. Protokół obejmuje propagację wirusa, karmienie krwią i oznaczanie zakażenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A. Namnożenie wirusa w linii komórkowej C6/36.
<ol>
<li>Hodować komórki do osiągnięcia 80% konfluencji w kolbie 75 cm2;</li>
<li>Usunąć pożywkę, pozostawiając w kolbie 3-4 ml;</li>
<li>Pobrać 0,5 ml zawisu wirusa i dodać do powyższych komórek przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 1,5 cząstki wirusa na komórkę. Powoli wstrząsać kolbą przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Inkubować przez 45 minut w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C</li>
<li>Dodać 30 ml pożywki i inkubować przez 5 dni.</li>
</ol>
B. Przygotowanie mieszaniny wirusa i krwi
<ol>
<li>Odczepić komórki za pomocą skrobaczki i przenieść komórki wraz z medium do probówek stożkowych o pojemności 50 mL;</li>
<li>Wirować przy 800g przez 10 minut; zebrać nadsącz, pozostawiając 1ml nadsączu z osadem komórkowym;</li>
<li>Zamrozić powyższy osad komórkowy&nbsp; w suchym CO2, a następnie rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C; powtórzyć czynność dwa do trzech razy;</li>
<li>Wirować przy 800g przez 10 minutes, zebrać nadsącz i połączyć go z nadsączem zebranym w kroku 3;</li>
<li>Pobrać pełną krew ludzką stosując tę samą procedurę (krok 3) w celu przygotowania kultury gametocytów do zakażenia komarów Anopheles pasożytem Plasmodium falciparum;</li>
<li>Połączyć równą ilość powyższej pełnej krwi ludzkiej z nadsączem wirusowym z kroku 4 i dodać surowicę ludzką (10% całkowitej objętości).</li>
<li>Inkubować powyższą mieszaninę krwi ludzkiej i wirusa dengi przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C</li>
</ol>
C. Karmienie komarów
Procedura ta jest niemal identyczna z opisaną w sekcji dotyczącej zakażeń Plasmodium falciparum u komarów. Stopień zakażenia jelita środkowego oceniamy w 7. dniu, a zakażenie gruczołów ślinowych w 14. dniu po pobraniu krwi. Wszystkie materiały, które miały kontakt z wirusem, są najpierw traktowane 75% etanolem, a następnie 10% wybielaczem.
D. Oznaczenie miana wirusa w tkance komara
<ol>
<li>Na dwa lub trzy dni przed sekcją tkanek komara należy wysiać komórki C6/36 na płytce 24-dołkowej w taki sposób, aby w dniu przeprowadzenia analizy osiągnęły one 80% konfluencji;</li>
<li>Komary należy znieczulić w temperaturze 4°C, uśmiercić i wysterylizować powierzchnię ciała, mocząc je w 75% etanolu przez 1 minutę. Następnie komary dwukrotnie przemyto sterylną wodą przed sekcją jelita środkowego lub ślinianek pod mikroskopem sekcyjnym. Od tego momentu wszystkie poniższe procedury muszą być wykonywane w środowisku sterylnym, np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Tkanki te przenosi się do probówki zawierającej 150 µl medium i homogenizuje za pomocą motorowego tłuczka Kontes przez 90 sekund;</li>
<li>Należy przygotować rozcieńczenie 1:100, dodając 10 µl homogenatu do 990 µl medium;</li>
<li>W płytce 96-dołkowej należy przygotować kolejne rozcieńczenia 1:10, 1:100 i 1:1000 w medium;</li>
<li>Należy usunąć medium z płytki 24-dołkowej i dodać 100 µl każdego z czterech powyższych rozcieńczeń do odpowiadających im dołków;</li>
<li>Płytkę należy powoli wstrząsać przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez 45 minut w 5% CO2 i 37°C;</li>
<li>Do każdego dołka należy dodać 1 ml nakładki z metylocelulozy (1%);</li>
<li>Płytki inkubować w 37°C przy 5% CO2 przez 5 dni;</li>
<li>Kolejne kroki nie wymagają środowiska sterylnego, jednak jak przy każdym innym patogenie, należy zachować ostrożność w każdym momencie. Usunąć nakładkę z metylocelulozy z każdej płytki i odsączyć nadmiar medium;</li>
<li>Do każdego dołka dodać 1 ml fiksaty z metanolu i acetonu (1:1). Przechowywać w 4°C przez 1 h;</li>
<li>Odlać fiksaty i przemyć raz 1X PBS;</li>
<li>Przygotować rozcieńczenie 1:1000 przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko wirusowi w 5% blotto;</li>
<li>Do każdego dołka dodać 200 µl rozcieńczonego płynu hiperimmunnego, inkubować w 37°C przez 1 h;</li>
<li>Usunąć płyn hiperimmuny i przemyć płytkę 1X PBS;</li>
<li>Przygotować rozcieńczenie 1:1000 koniugatu koziego anty-mysiego (KPL Cat# 074-1806) w 5% blotto (5 g mleka w proszku w 100 ml 1X PBS), a następnie dodać 200 µl do każdego dołka i inkubować w 37°C przez 1 h;</li>
<li>Przygotować substrat w następujący sposób: dodać 1 tabletkę tetrahydrochlorku 3'-diaminobenzydyny (Sigma Cat# D5905) do 20 ml 1X PBS, a po rozpuszczeniu dodać 8 µl 30% nadtlenku wodoru;</li>
<li>Do każdego dołka dodać 200 µl powyższego substratu. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut;</li>
<li>Usunąć substrat i zatrzymać reakcję, dodając 1 ml wody destylowanej do każdego dołka;</li>
<li>Odlać wodę i osuszyć płytki;</li>
<li>Policzyć cząstki wirusa;</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td><td>w 5% CO2, 37°C</td></tr><tr><td>probówki stożkowe 50 ml</td><td></td><td></td><td></td><td>tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>końcówka do pipety</td><td></td><td></td><td></td><td>do hodowli tkankowych </td></tr><tr><td>Pipettman</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety Pasteura</td><td></td><td></td><td></td><td>szkło, sterylnie</td></tr><tr><td>łaźnia wodna</td><td></td><td></td><td></td><td>37°C</td></tr><tr><td>wirówka</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>łaźnia wodna z cyrkulacją</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dozowniki z membraną szklaną</td><td></td><td></td><td></td><td>z gumowymi rurkami dopasowanymi do podajników</td></tr><tr><td>kubeczki do komarów</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór wybielacza</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych</td><td></td><td></td><td></td><td>płytki 6-dołkowe, 24-dołkowe i 96-dołkowe</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td></td><td></td><td></td><td>szkło</td></tr><tr><td>Slajdy</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinceta precyzyjna</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1X, sterylne</td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komórki C6/36</td><td>komórki</td><td></td><td></td><td>Do propagacji wirusa</td></tr><tr><td>pożywka C6/36</td><td></td><td></td><td></td><td>MEM z dodatkiem 10% nieaktywowanej termicznie FBS, 1% L-glutaminy i nieessentialnych aminokwasów oraz 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-Tetrachlorowodorek diaminobenzydyny</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1 tabletkę w 20 ml 1X PBS, rozpuścić, a następnie dodać 8 &amp;#x03BC;l 30% nadtlenku wodoru</td></tr><tr><td>30% nadtlenek wodoru</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*A. aegypti*</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>komar</td></tr></tbody></table>

protokół infekcji denga w komarach (a. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Celem niniejszej procedury jest zakażenie komarów z rodzaju Aedes wirusem dengi w warunkach laboratoryjnych oraz zbadanie poziomu infekcji i dynamiki wirusa w tkankach komara. Protokół ten jest rutynowo stosowany do badania interakcji między komarem a wirusem, w szczególności do identyfikacji nowych czynników gospodarza, które determinują kompetencję wektora. Cały eksperyment musi być przeprowadzony w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL2. Podobnie jak w przypadku zakażeń *Plasmodium falciparum*, przez cały czas należy nosić odpowiednią odzież ochronną, w tym rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Po zakończeniu eksperymentu wszystkie materiały, które miały kontakt z wirusem, muszą zostać poddane działaniu 75% etanolu oraz wybielacza przed przystąpieniem do standardowego mycia. Wszystkie pozostałe materiały należy poddać autoklawowaniu przed ich utylizacją.

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Celem niniejszej procedury jest zainfekowanie komarów z rodzaju Aedes wirusem dengi w warunkach laboratoryjnych oraz zbadanie poziomu i dynamiki infekcji ...

Nazywam się George Dimopoulos i zaprezentujemy Państwu procedurę infekcji komarów Aedes GTI wirusem dengue. Pierwszym krokiem będzie namnożenie wirusa w linii komórkowej Aedes albopictus. Nazywam się Jose Luis Ramirez i jestem doktorantem w laboratorium ous.Do przeprowadzenia tej procedury będziemy potrzebować laboratorium poziomu BSL 2 z komorą do hodowli tkanek oraz inkubatorem CO2 ustawionym na 37°C. Potrzebne będą plastikowe probówki stożkowe o pojemności 50 ml. Będziemy potrzebować ludzkiej surowicy, łaźni wodnej ustawionej na 37°C oraz wirówki.Potrzebujemy płytek 96-dołkowych oraz innych standardowych odczynników i materiałów eksploatacyjnych stosowanych w biologii molekularnej i biochemii. Znajdujemy się w standardowym dygestorium do hodowli tkankowych w laboratorium klasy BSL-2; pierwszym krokiem jest wyjęcie komórek, które osiągnęły 80% konfluencji w kolbie o powierzchni 75 cm². Jest to pożywka MEM z dodatkiem 10% inaktywowanej cieplnie płodowej surowicy bydlęcej, uzupełniona o 1% L-glutaminy oraz niezbędnych aminokwasów.Teraz dodamy wirusa dengue do komórek. Wyjęliśmy zapas wirusa z zamrażarki o temperaturze -80°C i rozmroziliśmy go w inkubatorze w temperaturze 37°C. Dodajemy około 0,5 ml zapasu wirusa do komórek, aby uzyskać stężenie wynoszące około 1,5 cząsteczki wirusa na komórkę.Następnie komórki umieszcza się na wytrząsarce przez około 15 minut przy niskiej prędkości wytrząsania. Następnie komórki przenosi się do inkubatora CO2 na około 45 minut. Temperatura wynosi 37 °C, a stężenie CO2 wynosi 5%. Po 45-minutowej inkubacji wyjmujemy komórki, dodajemy 30 ml pożywki, a następnie ponownie umieszczamy komórki w inkubatorze i inkubujemy przez kolejne pięć dni.Teraz przygotujemy cząstki wirusa do infekcji. Najpierw należy odczepić komórki z kolby za pomocą skrobaka, a następnie przenieść je wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie wirować komórki przy 12 000 RPM przez 10 minut, aby uzyskać osad.Na dnie tej probówki widoczny jest osad. Następnie usuniemy nadsącz, pozostawiając jedynie 1 ml z komórkami, aby doprowadzić do uwolnienia wirusa z komórek. Następnie je zamrozimy.Doprowadzi to do rozerwania komórek, po czym zostaną one rozmrożone, a następnie ponownie zamrożone; procedurę tę powtórzymy od trzech do czterech razy, przy czym mrożenie odbywa się na suchem lodzie. Po zamrożeniu osad komórkowy umieszcza się w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia, a następnie ponownie zamraża na suchym lodzie. Pomiędzy każdym etapem mrożenia resuspendujemy komórki poprzez wierzchołkowanie. Obecnie zbieramy supernatant zawierający wirusa i dodajemy go do supernatantu z poprzedniego wirowania, który również zawiera cząsteczki wirusa.Przygotowana zawiesina wirusa jest teraz gotowa do połączenia z równą ilością pełnej krwi ludzkiej oraz surowicy. Tutaj połączyliśmy preparat wirusa z pełną krwią ludzką uzupełnioną o 15% surowicy ludzkiej. Ten roztwór krwi z wirusem zostanie teraz wykorzystany do karmienia komarów i ich zakażania.Krew tę wprowadzimy do podajnika membranowego, który zostanie umieszczony na naczyniu z komarami; następnie pozwolimy komarom żerować na tej krwi przez około 25 minut. Na podajniku membranowym zamocowaliśmy klips w celu jego stabilizacji. Służy on w zasadzie do dociśnięcia go do siatki, a teraz wprowadzimy krew do podajnika.W niektórych przypadkach eksperyment ten może przynieść lepsze rezultaty, jeśli zostanie przeprowadzony w ciemności, ponieważ komary naturalnie często żerują w warunkach braku światła. Zależy to oczywiście od tego, w jaki sposób uwarunkowano kolonię komarów. Komary żerowały już przez około 25 do 30 minut, zatem możemy teraz wyjąć karmidło membranowe i umieścić je w bezpiecznym pojemniku w celu dekontaminacji.Po karmieniu krwią należy oddzielić komary, które nie przyjęły pokarmu, od tych nakarmionych. W tym celu uśpiliśmy komary, umieszczając małe kubki z nakarmionymi osobnikami w pomieszczeniu chłodniczym na okres od 5 do 10 minut. Jak widać, komary w niskiej temperaturze są już unieruchomione.Otwieramy pokrywę i przenosimy komary do małej szalki Petriego, która jest umieszczona w wiaderku z lodem, aby komary przez cały czas pozostawały w niskiej temperaturze i nie mogły uciec. Należy pamiętać, że są to komary zainfekowane, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dopuścić do ich uwolnienia. Po przeniesieniu komarów do pomieszczenia chłodniczego, przekazujemy je do standardowego insektrarium utrzymywanego w temperaturze pokojowej, jednak komary zawsze umieszczamy w szalce Petriego znajdującej się w wiaderku z lodem, aby pozostawały w stanie uśpienia.Widać, jak można odróżnić komary z grupy Fed od tych z grupy UNFI. Osobniki z grupy Fed mają w sobie krew. Są one w pełni syte.Niektóre z nich żywiły się krwią tylko częściowo, więc nie są w pełni syte. Mają niewielką ilość krwi w odwłoku, podczas gdy inne mają jej znacznie więcej. Te nienasycone nie posiadają żadnej krwi w odwłoku, dzięki czemu można bardzo łatwo odróżnić osobniki syte od nienasyconych.Przeniesiemy teraz komary z naczynia Petri do tekturowych kubków wyłożonych woskiem. Kolejnym krokiem jest analiza zakażenia wirusem dengue u komarów. Jeśli chcemy zbadać zakażenie wirusem w jelicie środkowym komara, należy przeprowadzić sekcję komarów około siódmego dnia po pobraniu przez nie posiłku krwi.Jeśli chcą Państwo zbadać infekcję wirusem w gruczołach ślinowych, należy przeprowadzić sekcję komarów około 14 dni po żerowaniu na krwi; Jose pokaże teraz, jak wypreparować jelito z komara. Komary zostały wcześniej znieczulone na lodzie, a następnie zabijemy je poprzez inkubację w 70% etanolu przez około jedną minutę. Następnie przenosimy komary do dwóch kolejnych kąpieli wodnych.Po jednej minucie na każdą próbkę. Ma to na celu wypłukanie etanolu z komarów. Teraz przeprowadzimy sekcję komarów w PBS na szkiełkach przedmiotowych.Najlepszym sposobem wypreparowania jelita środkowego z komara gatunku gyp time jest ułożenie owada odwróconego do góry nogami na skrzydłach, chwycenie części brzusznej jedną pęsetą, a klatki piersiowej drugą pęsetą, a następnie rozerwanie komara. Obecnie Jose rozrywa komara, a jelito pojawi się pomiędzy odwłokiem a klatką piersiową owada. Jelito to półprzezroczysta tkanka, która pojawiła się w górnej części komara.Teraz przeniesiemy wypreparowany przewód pokarmowy do pożywki dla linii komórkowych i przeniesiemy go pod dygestor do hodowli tkankowej, aby wyizolować cząsteczki wirusa z jelita. Przenosimy wypreparowane jelita środkowe do pomieszczenia do hodowli tkanek i homogenizujemy je za pomocą tłuczka, aby uwolnić cząsteczki wirusa. Po homogenizacji jelit środkowych dodajemy do homogenatu pożywkę, aby uzyskać rozcieńczenie cząsteczek wirusa w stosunku 1:100.Następnie kontynuujemy dalsze rozcieńczanie w stosunku 1:10, od 1:100 do 1:1000. Na płytce 96-dołkowej przygotowaliśmy linię komórkową Alba picto o 80% konfluencji w płytce 24-dołkowej. Następnie usuwamy nadosad z komórek hiatus alba picto, a do tych komórek dodajemy rozcieńczone cząsteczki wirusa, aby określić stężenie cząsteczek wirusa w każdym rozcieńczeniu.Pozwoli to na określenie poziomu infekcji wirusem. Następnie komórki z jelita środkowego komara są powoli wstrząsane przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieszczamy komórki na 45 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.Następnie do każdej studni dodajemy 1 ml 1% nakładki z metylocelulozy, a następnie płytkę ponownie inkubujemy w inkubatorze z CO2 w temperaturze 37°C przez pięć dni. Po pięciodniowej inkubacji dodajemy do każdej studni 1 ml utrwalacza z acetonu i metanolu. Następnie inkubujemy płytkę w temperaturze 4°C w lodówce przez jedną godzinę.Następnie usuwamy utrwalacz i jednokrotnie przemywamy każdą studzienkę roztworem PBS. W kolejnym kroku przygotowujemy rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko wirusowi dengue w stosunku 1:1000 w 5% roztworze krwi. Następnie dodajemy 200 µL tego roztworu przeciwciał.Do każdej studni przenieś zawartość. Następnie inkubujemy płytkę przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie usuwamy płyn hiperimmunny i przemywamy każdą studnię za pomocą jednego XPBS.Następnie powtarzamy tę procedurę w dokładnie ten sam sposób z użyciem przeciwciała wtórnego. Przygotowujemy 20 ml substratu zgodnie z protokołem i przelewamy go do pojemnika. Następnie do każdego dołka dodajemy 200 µl substratu.Następnie zatrzymujemy reakcję poprzez usunięcie substratu i dodajemy 1 ml wody destylowanej do każdej studzienki. Potem wylewamy wodę z płytki i pozostawiamy ją do wyschnięcia. Każda kolorowa kropka reprezentuje plakę wirusów, a licząc te plaki, możemy oszacować liczbę cząsteczek wirusa, które znajdowały się w pierwotnym jelicie środkowym homogenizowanego komara.Właśnie zaprezentowaliśmy procedurę przeprowadzania infekcji wirusem dengi u komarów aegypti. Protokół ten obejmuje produkcję wirusa w linii komórkowej komarów. Cząsteczki wirusa są następnie oczyszczane z linii komórkowej i izolowane, a następnie mieszane z pełną krwią ludzką i podawane komarom do spożycia.Wirus zainfekuje komary, a po ustanowieniu infekcji pokazaliśmy, jak wyizolować tkankę jelita środkowego komara oraz jak określić poziom infekcji tego jelita środkowego. W zasadzie homogenizujemy jelito środkowe i stosujemy procedurę uwalniania cząsteczek wirusa z tej tkanki. Następnie wykorzystujemy te cząsteczki wirusa do ponownej infekcji linii komórkowej komara, aby określić poziom infekcji jelita środkowego, czyli liczbę cząsteczek wirusa, które zainfekowały jelito środkowe komara.

protocol-for-dengue-infections-mosquitoes-aegypti-infection-phenotype

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół dotyczący infekcji dengue u komarów (A. aegypti) i oznaczania fenotypu infekcji

Podejścia genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za oporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Jamesa do wstrzykiwania dsRNA samicom komarów A. aegypti, będących nosicielami wirusa dengue. Przedstawiono technikę kalibracji igieł wstrzykujących, obsługi zestawu do iniekcji oraz wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej.

Iniekcja dsRNA do samic komarów A. aegypti

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Protokół hodowli pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis. Pasożyt przechodzi z jednego pokolenia komarów Aedes aegypti do następnego poprzez przenoszenie poziome w stadium larwalnym, a następnie przenoszenie pionowe w stadium dorosłym. Żywe sporoplazmy przeżywają długotrwale w zakażonych jajach.

Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Poznaj metodę zakażenia komarów Aedes aegypti wirusem dengi w celu badania genów odpowiedzialnych za odporność na infekcję. Protokół obejmuje propagację wirusa, karmienie krwią i oznaczanie zakażenia.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Przeglądaj więcej filmów