Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

W tym filmie pokażemy, jak wyizolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i wyhodować je w hodowli, aby utworzyć klonalne sfery siatkówki. Sfery, które są izolowane, posiadają kardynalne właściwości komórek macierzystych: samoodnawianie się i multipotencjalność.

Ogólnym celem tego zabiegu jest wyizolowanie komórek macierzystych siatkówki z nabłonka rzęskowego oka. Osiąga się to poprzez najpierw oczyszczenie i przecięcie oka na pół, zaczynając od nerwu wzrokowego, przecinając rogówkę i spotykając się z powrotem na nerwie wzrokowym, a następnie usuwając siatkówkę nerwową i soczewkę. Drugim etapem zabiegu jest wycięcie nabłonka rzęskowego poprzez odcięcie tęczówki rogówki i nabłonka barwnikowego siatkówki.

Trzecim etapem zabiegu jest enzymatyczne potraktowanie nabłonka rzęskowego, usunięcie twardówki i mechaniczna dysocjacja nabłonka na pojedyncze komórki. Ostatnim etapem zabiegu jest ponowne zawieszenie komórek w pożywce wolnej od surowicy i umieszczenie ich na płytkach do hodowli tkankowych zawierających pożywkę wolną od surowicy z czynnikami wzrostu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują prospektywnie liczbę komórek macierzystych znajdujących się w nabłonku rzęskowym oka poprzez sferę klonalną, tworzenie in vitro.

Cześć, nazywam się Brenda Coles. Nasze laboratorium po raz pierwszy wymyśliło tę metodę, gdy badaliśmy prace na temat zdolności regeneracyjnych i ryb w ich oczach i postawiliśmy hipotezę, że być może w oku ssaków znajduje się komórka o takich samych możliwościach. Izolacja komórek macierzystych siatkówki odbywa się w specjalnym sterylnym pomieszczeniu przeznaczonym do eksperymentów z hodowlą pierwotną.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy ustawić mikroskop preparacyjny i źródło zimnego światła, a następnie rozłożyć sterylne narzędzia sekcyjne. Każdy okap posiada sterylizator na gorąco do sterylizacji narzędzi między krokami. Wyizolujemy komórki macierzyste siatkówki z oczu, które zostały natychmiast umieszczone na sterylnej szalce Petriego zawierającej sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy Po usunięciu z myszy uśmierconych zgodnie z zatwierdzonymi protokołami etyki zwierząt, Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest wypreparowanie okrągłego przedmiotu pod mikroskopem.

Należy zachować dużą ostrożność, aby nie zniszczyć interesującej tkanki Pod mikroskopem preparacyjnym oczyść oko kleszczami. Pozbądź się włosów i połączonej tkanki, która jest przyczepiona do granicy rogówki i twardówki. Następnie przenieś oko do nowego naczynia z płynem mózgowo-rdzeniowym, trzymając oko nieruchomo za pomocą ząbkowanych kleszczyków.

Użyj kątowych nożyczek do mikropreparowania, aby usunąć mięśnie oka. Usuń również nerw wzrokowy, jeśli jest nadal przyczepiony do oka, staraj się nie zgniatać oka podczas tego procesu. Przenieś oczy do nowego naczynia za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego.

Następnie użyto zakrzywionych nożyczek do mikropreparacji, aby przeciąć oko na pół. Rozpocznij od nerwu wzrokowego i przetnij środek rogówki, spotykając się z powrotem przy nerwie wzrokowym, w którym rozpoczęto cięcie. Idealnie jest, jeśli dwie części oka są mniej więcej tej samej wielkości, ponieważ ułatwi to następny krok.

Trzymając rogówkę za pomocą dwóch kleszczy, delikatnie rozsuń dwie połówki oka. Usuń i wyrzuć soczewki, wnętrzności i siatkówkę nerwową z muszli oczu. Przenieś muszle do nowego naczynia z płynem mózgowo-rdzeniowym.

Teraz jesteśmy gotowi do wyizolowania nabłonka rzęskowego. Na początek ustaw powłokę oka tak, aby rogówka znajdowała się po prawej stronie, a pigmentowany nabłonek siatkówki po lewej. Delikatnie przypnij muszlę oka prostymi kleszczami po stronie RPE.

Następnie użyj skalpela, aby odciąć rogówkę i tęczówkę od nabłonka rzęskowego oka, delikatnie naciskając na skalpel, zamiast wykonywać ruchy piłowania. Następnie odetnij nabłonek rzęskowy od RPE. Użyj nieząbkowanych kleszczy, aby przenieść pasek nabłonka rzęskowego do nowego 35-milimetrowego naczynia zawierającego płyn mózgowo-rdzeniowy.

W ten sam sposób odizoluj nabłonek rzęskowy od drugiej powłoki oka. Po zebraniu pasków nabłonka rzęsek przenieś paski do 35-milimetrowego naczynia zawierającego dwa mililitry dysprzestrzeni. Umieść naczynie z paskami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.

Po 10 minutach przenieś paski z dys do naczynia zawierającego dwa mililitry przefiltrowanych kroplówek w Halle Ur Haase i rodzaju kwasu rekowego. Postaw naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Teraz wróć do mikroskopu preparacyjnego, przytrzymując twardówkę prostymi kleszczami.

Użyj dolnej części krzywych kleszczyków bez oceny, aby delikatnie zeskrobać nabłonek rzęskowy z twardówki. Wyjmij twardówkę z naczynia. Wszystko to powinno pozostać w naczyniu.

Teraz są interesujące komórki i roztwór enzymu. Za pomocą polerowanej na ogień bawełnianej pipety z zatyczką przenieś roztwór do 14-litrowej probówki. Potrzepać ten roztwór 30 razy, aby rozbić komórki nabłonka, delikatnie wtłaczając i wypychając roztwór z pipety, odwiruj probówkę przez pięć minut z prędkością 1500 obr./min.

Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki. Ponieważ komórki mają skłonność do odpadania od dna rurki. Na tym etapie delikatnie odessać większość SuperNet za pomocą wypolerowanej pipety, a następnie dodać jeden mililitr inhibitora trypsyny w pożywce wolnej od surowicy do komórek.

Użyj pipety z małym odwiertem z bawełnianym korkiem, aby przetworzyć próbkę około 50 razy, aż stanie się zawiesiną jednokomórkową. Ponownie odwirować probówkę przez pięć minut. Przy 1500 obr./min usuń supernatant i zastąp go jednym mililitrem powłoki.

Podłoże delikatnie schłodzić za pomocą pipety z polerowanego szkła w celu ponownego zawieszenia komórek. Po zliczeniu komórek nanieś je na żądaną gęstość. Na płytce 24-dołkowej zwykle podajemy 10 komórek na mikrolitr, wypełniając najpierw każdą studzienkę pożywką, a następnie dodając zawiesinę komórek, aby uzyskać końcową objętość 500 mikrolitrów pożywki.

Umieść płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, gdzie nie będzie się poruszać, dopóki nie policzysz kulek, które pojawią się po siedmiu dniach, gdy ta procedura zostanie wykonana pomyślnie. Wypreparowane komórki nabłonka rzęsek powinny wyglądać tak po dysocjacji i posianiu w niskiej gęstości. Po siedmiu dniach w hodowli liczy się powstające kulki komórek macierzystych siatkówki.

Kula powinna mieć średnicę ponad 75 mikronów i swobodnie unosić się, aby można ją było zaliczyć do kuli pochodzącej z komórek macierzystych. Jednak niektóre komórki będą miały ograniczoną proliferację i będą tworzyć PHE, które nie spełniają kryterium wielkości i nie będą liczone jako sfery pochodzące z komórek macierzystych. Przykład takiej planetoidy pokazany jest tutaj Po jej wyrozwojowiu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny nauk o wzroku do zbadania możliwości wykorzystania komórek macierzystych siatkówki w leczeniu chorób siatkówki.