Name: Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj izolację komórek macierzystych siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i ich hodowlę w formie sfer. Ta metoda umożliwia badanie właściwości komórek macierzystych w regeneracyjnej terapii chorób siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laurze Clarke za nieocenioną pomoc. Praca ta jest wspierana przez NCE: Stem Cell Network, CIHR oraz NIH.

1. Przygotowanie roztworów do sekcji i roztworów enzymów
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) oraz medium bezełkowe i przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Odważyć kwas kynurenowy (0,2 mg/mL) i rozpuścić go wcześniej w 10 mL hilo ACSF w kąpieli wodnej o temperaturze 37° C, ponieważ substancja ta nie rozpuszcza się łatwo.</li>
	<li>Odważyć trypsynę (1,33 mg/mL) oraz hialuronidazę (0,67 mg/mL), umieścić w jednej probówce o pojemności 15 mL i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia. Bezpośrednio przed zastosowaniem dodać do tej probówki roztwór kwasu kynurenowego i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 2 μm.</li>
	<li>Odważyć inhibitor trypsyny (owamukoid: 1 mg/mL), rozpuścić w ciepłym medium bezełkowym i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 2 μm.</li>
	<li>Przygotować medium do wysiewu: medium bezełkowe zawierające FGF2 (10 ng/mL) i heparynę (2 μg/mL).</li>
</ol>
2. Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy
<ol>
	<li>Izolację komórek macierzystych siatkówki przeprowadza się w specjalnym sterylnym pomieszczeniu przeznaczonym do eksperymentów z kulturami pierwotnymi. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować mikroskop stereoskopowy oraz źródło zimnego światła, a następnie rozłożyć sterylne narzędzia do mikrodissekcji. Każdy okap wyposażony jest w sterylizator kuleczkowy do sterylizacji narzędzi pomiędzy poszczególnymi etapami.</li>
	<li>Komórki macierzyste siatkówki będziemy izolować z oczu, które po wyjęciu z myszy uśpionych zgodnie z zatwierdzonymi protokołami etyki dotyczącymi zwierząt, zostały niezwłocznie umieszczone w sterylnym naczyniu Petri zawierającym sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF).</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym należy oczyścić oko za pomocą pęsety: usunąć włosy oraz tkankę łączną przylegającą do granicy rogówki i twardówki. Następnie przenieść oko do nowego naczynia z ACSF.</li>
	<li>Trzymając oko delikatnie i nieruchomo za pomocą pęsety ząbkowej, użyć skośnych nożyczek do mikrodissekcji, aby usunąć mięśnie gałki ocznej. Należy również usunąć nerw wzrokowy, jeśli nadal jest przytwierdzony do oka. Podczas tego procesu należy starać się nie zgniatać oka. Przenieść oczy do nowego naczynia z ACSF.</li>
	<li>Następnie użyć zakrzywionych nożyczek do mikrodissekcji, aby przeciąć oko na pół: zacząć od nerwu wzrokowego i przeciąć przez środek rogówki, wracając do miejsca rozpoczęcia cięcia przy nerwie wzrokowym. Idealnie byłoby, gdyby obie części oka były mniej więcej tej samej wielkości, co ułatwi kolejny krok.</li>
	<li>Trzymając rogówki za pomocą dwóch pęset, delikatnie rozdzielić dwie połowy oka. Usunąć i odrzucić soczewkę, zawartość wnętrza oka oraz siatkówkę neuronową z pochewek oka. Przenieść pochewki do nowego naczynia z ACSF.</li>
	<li>Teraz można przystąpić do izolacji nabłonka rzęsistego. Na początek zorientować pochewkę oka tak, aby rogówka znajdowała się po prawej stronie, a nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) po lewej. Delikatnie przytrzymać pochewkę oka prostą pęsetą od strony RPE.</li>
	<li>Następnie za pomocą skalpela oddzielić rogówkę i tęczówkę od nabłonka rzęsistego oka, delikatnie naciskając skalpel w dół, zamiast stosować ruchy piłujące.</li>
	<li>Po tym odciąć nabłonek rzęsisty od RPE. Użyć pęsety nieząbkowej, aby przenieść pasek nabłonka rzęsistego do nowego naczynia 35-mm zawierającego ACSF.</li>
	<li>W ten sam sposób wyizolować nabłonek rzęsisty z drugiej pochewki oka.</li>
	<li>Po zebraniu obu pasków nabłonka rzęsistego przenieść je do naczynia 35-mm zawierającego 2 mL Dispase. Umieścić naczynie z paskami w inkubatorze w temperaturze 37° C na 10 minut.</li>
	<li>Po 10 minutach przenieść paski z Dispase do naczynia zawierającego 2 mL filtrowanej trypsyny, hialuronidazy i kwasu kynurenowego. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Powrócić do mikroskopu stereoskopowego. Przytrzymując twardówkę prostą pęsetą, użyć końcówki zakrzywionej pęsety nieząbkowej, aby delikatnie zeskrobać nabłonek rzęsisty z twardówki.</li>
	<li>Usunąć twardówkę z naczynia. W naczyniu powinny pozostać teraz jedynie interesujące nas komórki oraz roztwór enzymatyczny.</li>
	<li>Za pomocą wypalanej pipety z watowym korkiem przenieść ten roztwór do probówki 14-ml. Przeprowadzić triturację roztworu 30 razy, aby rozbić komórki nabłonkowe, delikatnie wciągając i wypuszczając roztwór z pipety.</li>
	<li>Wirować probówkę przez 5 minut przy 150 RPM. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjąć probówkę z wirówki, ponieważ na tym etapie komórki mają tendencję do odrywania się od dna probówki.</li>
	<li>Delikatnie odessać większość supernatantu za pomocą wypalanej pipety, a następnie dodać do komórek 1 mL inhibitora trypsyny w medium bezsurowiczym. Użyć pipety z wąskim otworem i watowym korkiem, aby triturować próbkę około 50 razy, aż powstanie zawiesina pojedynczych komórek.</li>
	<li>Ponownie wirować probówkę przez 5 minut przy 150 RPM.</li>
	<li>Usunąć supernatantu i zastąpić go 1 mL medium do wysiewu. Delikatnie triturować za pomocą wypalanej pipety szklanej, aby resuspendować komórki.</li>
	<li>Po policzeniu komórek wysiać je z pożądaną gęstością na płytkę 24-dołkową. Zazwyczaj wysiewamy 10 komórek/μL, wypełniając każdy dołek najpierw medium, a następnie dodając zawiesinę komórkową, aby uzyskać końcową objętość 50 μL medium.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37° C, gdzie nie będzie ona przemieszczana aż do momentu policzenia sfer, które pojawią się po 7 dniach.</li>
</ol>
3. Wyniki izolacji komórek macierzystych siatkówki
<ol>
	<li>Po pomyślnym przeprowadzeniu tej procedury, wypreparowane komórki nabłonka rzęsnego po dysocjacji i wysianiu przy niskiej gęstości powinny wyglądać w ten sposób (Rycina 1).</li>
	<li>Po 7 dniach hodowli należy policzyć powstałe sfery macierzystych komórek siatkówki. Aby sfera została policzona jako sfery pochodzące z komórek macierzystych, musi mieć średnicę powyżej 75 μm i być wolno pływająca (Rycina 2). Jednak niektóre komórki będą wykazywać ograniczoną proliferację i tworzyć sferoidy, które nie spełniają kryterium wielkości i nie zostaną policzone jako sfery pochodzące z komórek macierzystych; przykład takiego sferoidu pokazano tutaj (Rycina 2).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy, obserwacja komórek, pasek skali 50 μm, badania biologiczne, badanie komórkowe" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1.
<img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy pyłu zawieszonego; sfera RSC w porównaniu z mniejszymi cząstkami, skala 10 µm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji komórek macierzystych siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy 1-3. Metodyka izolacji pasków nabłonka rzęskowego może być zróżnicowana, jednak w tym protokole zoptymalizowano enzymy oraz metodologię uzyskiwania zawiesiny pojedynczych komórek. Ważne jest również, aby wyizolowane paski nabłonka rzęskowego nie zawierały dużych ilości nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) ani rogówki, ponieważ wydają się one negatywnie wpływać na całkowitą liczbę sfer, które można wyizolować z każdego oka. Ponadto stosowane przez nas bezsurowicze medium, pierwotnie sformułowane dla neurosfer mózgowych 13, jest idealne do hodowli sfer komórek macierzystych siatkówki. Należy również upewnić się, że komórki nie są niepokojone po ich wysianiu i umieszczeniu w inkubatorze, aby rosnące sfery nie ulegały agregacji 14.
Po utworzeniu przez komórki macierzyste siatkówki sfer klonalnych można je przeliczyć, aby uzyskać przybliżoną liczbę komórek macierzystych na oko. Następnie sfery można dysocjować do pojedynczych komórek i pasażować w celu oceny zdolności do samoodnowy lub różnicować w różne typy komórek siatkówki nerwowej i RPE, stosując różne kombinacje czynników wzrostu i/lub białek.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zimne źródło światła</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>optyczne światło z podwójnym ramieniem</td></tr><tr><td>Zakrzywione mini nożyczki Vannasa</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Kątowe nożyczki Vannasa</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 7</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>nieząbkowana</td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>prosta</td></tr><tr><td>Pinceta precyzyjna</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>ząbkowana zakrzywiona</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela nr 3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela nr 10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator koralikowy</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kwas kynurenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipety z watowym czopkiem</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>polerowane ogniowo</td></tr><tr><td>Probówki 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>Poziom medium bezsurowiczego</td><td></td><td></td><td>Ref# 13 w celu uzyskania składu</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Dorosła mysia komórka macierzysta siatkówki (RSC) jest rzadką, spoczywającą komórką występującą w nabłonku rzęskowym (CE) oka ssaków1,2,3. CE składa się z niebarwnej warstwy wewnętrznej oraz barwnej warstwy zewnętrznej komórek, a klonalne kolonie RSC powstające z jednej barwnej komórki CE składają się zarówno z komórek barwnych, jak i niebarwnych, które mogą różnicować się w wszystkie typy komórek siatkówki nerwowej i nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). Istnieją pewne kontrowersje co do tego, czy wszystkie komórki w obrębie sfer zawierają przynajmniej niewielką ilość pigmentu4; niemniej jednak komórki te nadal są zdolne do tworzenia różnych typów komórek występujących w siatkówce nerwowej1-3. U niektórych gatunków, takich jak płazy i ryby, oczy są zdolne do regeneracji po urazie5; jednak oko ssaków nie wykazuje takich właściwości regeneracyjnych. Dążymy do zidentyfikowania komórki macierzystej in vivo oraz zrozumienia mechanizmów, które utrzymują komórki macierzyste siatkówki ssaków w stanie spoczynku6-8, nawet po urazie, a także do wykorzystania ich jako potencjalnego źródła komórek wspomagających naprawę fizycznych lub genetycznych modeli uszkodzeń oka poprzez transplantację9-12. W niniejszym protokole opisujemy sposób izolacji komórek nabłonka rzęskowego z oka myszy oraz ich hodowlę w celu utworzenia klonalnych sfer komórek macierzystych siatkówki. Ponieważ nie są znane żadne markery komórek macierzystych in vivo, sfery te stanowią jedyny znany sposób na prospektywną identyfikację populacji komórek macierzystych w nabłonku rzęskowym oka.

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Dorosła komórka macierzysta siatkówki (RSC) myszy jest rzadką, spoczynkową komórką występującą w nabłonku rzęskowym (CE) oka ssaków1,2,3. Nabłonek rzęskowy składa się z ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek macierzystych siatkówki z nabłonka rzęskowego oka. Jest to osiągane poprzez uprzednie oczyszczenie i przecięcie oka na pół, zaczynając od nerwu wzrokowego, przecinając rogówkę i kończąc cięcie ponownie na nerwie wzrokowym, a następnie usunięcie siatkówki neuronalnej oraz soczewki. Drugim krokiem procedury jest wycięcie nabłonka rzęskowego poprzez usunięcie rogówki, tęczówki oraz nabłonka pigmentowego siatkówki.Trzecim krokiem procedury jest opracowanie enzymatyczne nabłonka rzęskowego, usunięcie twardówki oraz mechaniczna dysocjacja nabłonka do pojedynczych komórek. Ostatnim etapem procedury jest resuspensja komórek w pożywce bezsurowiczej i ich wysianie na płytki do hodowli tkankowej zawierające pożywkę bezsurowiczą z czynnikami wzrostu. W efekcie można uzyskać wyniki, które prospektywnie wykazują liczbę komórek macierzystych obecnych w nabłonku rzęskowym oka poprzez tworzenie sfer klonalnych in vitro.Witajcie, nazywam się Brenda Coles. Nasz zespół opracował tę metodę podczas analizy publikacji dotyczących zdolności regeneracyjnych oczu płazów i ryb, stawiając hipotezę, że w oku ssaków może występować komórka o podobnych właściwościach. Izolacja macierzystych komórek siatkówki jest przeprowadzana w specjalnym pomieszczeniu sterylnym, przeznaczonym do eksperymentów z kulturami pierwotnymi.Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować stereomikroskop oraz zimne źródło światła, a następnie rozłożyć sterylne narzędzia do sekcji. Każdy dygestorium posiada sterylizator wysokotemperaturowy do sterylizacji narzędzi pomiędzy poszczególnymi etapami. Wyizolujemy komórki macierzyste siatkówki z oczu, które po pobraniu z myszy uśmierconych zgodnie z zatwierdzonymi protokołami etycznymi dotyczącymi zwierząt, zostały natychmiast umieszczone w sterylnej płytce Petri zawierającej sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest sekcja obiektu okrągłego pod mikroskopem.Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić badanej tkanki. Pod mikroskopem stereoskopowym oczyść oko za pomocą pęsety. Usuń włosy oraz tkankę łączną przylegającą do brzegu rogówkowo-twardówkowego. Następnie przenieś oko do nowej szalki z A CSF, unieruchamiając je pęsetą ząbkowaną.Użyj kątowych nożyczek do mikrodysekcji, aby usunąć mięśnie gałki ocznej. Usuń również nerw wzrokowy, jeśli nadal jest przytwierdzony do oka, starając się nie zmiażdżyć gałki ocznej podczas tego procesu. Przenieś oczy do nowej szalki z CSF.Następnie użyto zakrzywionych nożyczek mikrochirurgicznych do przecięcia oka na pół. Należy rozpocząć od nerwu wzrokowego i ciąć przez środek rogówki, aż do ponownego dotarcia do miejsca rozpoczęcia cięcia przy nerwie wzrokowym. Najlepiej, aby obie części oka były mniej więcej tej samej wielkości, co ułatwi wykonanie kolejnego kroku.Trzymając rogówki za pomocą dwóch pincet, delikatnie rozdziel dwie połowy oka. Usuń i odrzuć soczewki, bebechy oraz siatkówkę neuronalną z opuszek gałek ocznych. Przenieś opuszki do nowej szalki z A CSF.Teraz jesteśmy gotowi do wyizolowania nabłonka rzęsowego. Na początek zorientuj skorupę gałki ocznej tak, aby rogówka znajdowała się po prawej stronie, a nabłonek barwnikowy siatkówki po lewej stronie. Delikatnie przymocuj skorupę gałki ocznej za pomocą pęsety prostej po stronie RPE.Następnie za pomocą skalpela oddziel rogówkę i tęczówkę od nabłonka rzęskowego oka, delikatnie naciskając skalpel zamiast wykonywać ruchy piłujące. Po tym etapie oddziel nabłonek rzęskowy od RPE. Używając pęsety nieząbkowanej, przenieś pasek nabłonka rzęskowego do nowej szalki 35 mm zawierającej A CSF.W ten sam sposób wyizoluj nabłonek rzęsny z drugiej skorupy oka. Po zebraniu pasków nabłonka rzęsnego przenieś je do szalki 35 mm zawierającej 2 mL dis space. Umieść szalkę z paskami w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut.Po 10 minutach przenieś paski z przestrzeni do naczynia zawierającego dwa mililitry filtrowanych kropli w Halle ur haase i kwasie reic. Umieść naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie wróć do mikroskopu dissectingowego, dociskając twardówkę za pomocą pęsety prostej.Używając zakrzywionych pęsety nieząbkowanej, delikatnie zeskrobcie nabłonek rzęsowy zetkaną ze twardówki. Usuńcie twardówkę z naczynia. W naczyniu powinno pozostać jedynie to.Obecnie dysponujemy komórkami docelowymi oraz roztworem enzymu. Używając pipety z watową zatyczką wypalaną nad ogniem, przenieś roztwór do probówki o pojemności 14 litrów. Poddaj ten roztwór tryturacji 30 razy, aby rozbić komórki nabłonkowe, delikatnie wciągając i wypuszczając roztwór z pipety, a następnie wiruj probówkę przez pięć minut przy 1500 RPM.Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, ponieważ komórki mogą łatwo oddzielić się od dna probówki. Na tym etapie delikatnie odessa większość SuperNet za pomocą wypalanej pipety, a następnie dodaj do komórek jeden mililitr inhibitora trypsyny w medium bezsurowiczym.Użyj pipety z wąskim otworem zatkanym watą, aby rozbić próbkę, pipetując ją około 50 razy, aż powstanie zawiesina pojedynczych komórek. Ponownie odwiruj probówkę przez pięć minut przy 1500 RPM, usuń nadsącz i zastąp go jednym mililitrem medium do wysiewu.Pożywkę należy delikatnie wymieszać za pomocą wypalanej szklanej pipety, aby resuspenderować komórki. Po zliczeniu komórek należy wysiać je z pożądaną gęstością. W płytce 24-dołkowej zazwyczaj wysiewamy 10 komórek na mikrolitr, napełniając najpierw każdy dołek pożywką, a następnie dodając suspensję komórkową, aby uzyskać końcową objętość 500 mikrolitrów pożywki.Umieść płytkę w inkubatorze z CO2 w temperaturze 37°C, gdzie powinna pozostać nieruchoma aż do momentu przeliczenia sfer, które pojawią się po siedmiu dniach w przypadku prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podzielone komórki nabłonka rzęsek po dysocjacji i wysianiu przy niskiej gęstości powinny wyglądać w ten sposób. Po siedmiu dniach hodowli przelicza się powstałe sfery komórek macierzystych siatkówki.Sfera powinna mieć średnicę powyżej 75 mikronów i być wolno zawieszona, aby mogła zostać zaliczona jako sfera pochodząca z komórek macierzystych. Jednak niektóre komórki będą wykazywać ograniczoną proliferację i tworzyć PHE, które nie spełniają kryterium wielkości i nie zostaną zaliczone jako sfery pochodzące z komórek macierzystych. Przykład takiego asteroidu pokazano tutaj po jego rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie nauk o widzeniu do zbadania możliwości wykorzystania macularnych komórek macierzystych w leczeniu chorób siatkówki.

isolation-of-retinal-stem-cells-from-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka mysiego

Ten film demonstruje procedurę izolowania mysich pierwotnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na przyszłe badania RGC, w celu lepszego zrozumienia poważnego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Izolowanie mysich komórek zwojowych siatkówki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Opisujemy prostą i skuteczną metodę izolowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od oczu młodych pigmentowanych świnek morskich. Procedura ta pozwala na dalsze badania biologii molekularnej wyizolowanego RPE, w tym analizy ekspresji genów.

Izolacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świnki morskiej

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj izolację komórek macierzystych siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i ich hodowlę w formie sfer. Ta metoda umożliwia badanie właściwości komórek macierzystych w regeneracyjnej terapii chorób siatkówki.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Przeglądaj więcej filmów