Transdukcja retrowirusowa receptorów limfocytów T w mysich komórkach T

Celem tej procedury jest ekspresja funkcjonalnych receptorów limfocytów T specyficznych dla antygenu na mysich limfocytach T. Po pierwsze, transfekować linię komórkową wytwarzającą retrowirusa plazmidem zawierającym gen TCR będący przedmiotem zainteresowania w celu zapakowania retrowirusa eksprymującego TCR. Następnie wyizoluj i oczyść limfocyty T ze śledziony myszy, zainfekuj te oczyszczone limfocyty T retrowirusem wyprodukowanym w pierwszym etapie.

Na koniec rozszerz transdukowane limfocyty T w celu ekspresji i uzyskania znacznych poziomów receptora. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ekspresję funkcjonalnych TCR specyficznych dla antygenu na mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej. Cześć, nazywam się Michelle Crow Guard.

Jestem w Instytucie Raka Uniwersytetu Nowojorskiego w Szkole Medycznej Uniwersytetu Nowojorskiego. Dzisiaj pokażemy Ci, jak transdukować pierwotną komórkę T, ludzie, którzy będą Ci pokazywać, jak to zrobić, to Shiong, doktorant w laboratorium, Kaleena Melek, doktorantka w laboratorium i Arian Perez Garcia, doktorant w laboratorium. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak myszy transgeniczne, jest to, że jest ona znacznie mniej czasochłonna.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania immunologiczne, takie jak to, który TCR może dać lepszą odpowiedź na antygeny. Technika ta może być stosowana w adoptywnej terapii transferu komórek T, która, jak wykazano, jest obiecująca w leczeniu pacjentów z rakiem i polega na modyfikacji in vitro ludzkich komórek T w celu zapewnienia równej ekspresji łańcuchów alfa i beta receptora komórek T. Subklonować gen będący przedmiotem zainteresowania do tego samego wektora retrowirusowego pod kontrolą tego samego promotora.

Przygotuj wysokiej jakości DNA osocza za pomocą zestawu przygotowawczego Kyogen Maxi i przygotuj zapas jednego mikrograma na mikrolitr. Usunąć pożywkę z płytki z retrowirusowymi ogniwami opakowaniowymi platyny E i umyć płytkę raz jednym XPBS. Usuń komórki, dodając trypsynę EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kilka minut.

Zneutralizuj usunięte komórki za pomocą pożywki DMEM i przenieś do probówki Falcon. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut. Odessać supinat i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM.

Określ liczbę komórek i rozcieńcz komórki w proporcji 0,6 razy 10 do sześciu na mililitr płytki. 10 mililitrów zawiesiny komórek na 10-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej polilizyną i hoduj przez noc w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby zweryfikować około 80% płynności CO.

Delikatnie wyjmij nośnik z płyty. Umyj komórki raz jednym XPBS i dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej świeżej pożywki DMEM bez penicyliny lub streptomycyny. Dla kompleksu transfekcji wargowej należy przygotować dwie mieszaniny i zoptymalizować ME M1 odczynnika DNA i drugi odczynnika do lipektomii oddzielnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut. W temperaturze pokojowej powoli wlej mieszaninę do ogniw platynowych E. Delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę transfekcji.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym. Po sześciu do ośmiu godzinach zastąp pożywkę 10 mililitrami świeżej pożywki DMEM do produkcji wirusa. Zbierz śledzionę myszy i przenieś na podłoże RPMI.

Umieść śledzionę w sitku do komórek. Rozgnieć śledzionę tłokiem strzykawki na pięciocentymetrową płytkę do hodowli tkankowej. Wypłukać komórki z sitka komórkowego sterylnym PBS w celu zebrania komórek, odwirować w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut.

Wyrzuć sup natant. Kontynuuj przez Resus, zawieszając osad komórkowy w buforze lizującym CK. Dodając dwa mililitry na śledzionę, inkubować przez dwie minuty.

W temperaturze pokojowej. Dodaj pożywkę RPMI do 20 mililitrów i odwiruj w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w sterylnym PBS.

Określ liczbę komórek i odwiruj w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu aktywacji mysich limfocytów T przed transdukcją wirusa należy pokryć płytki przeciwciałami aktywującymi, a mianowicie anty CD three epsilon i anty CD 28. Przygotować mieszaninę przeciwciał o stężeniu jednego mikrograma na mililitr anty CD, trzech epsilonów i dwóch mikrogramów na mililitr anty CD 28 w sterylnym PBS, dozować 250 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Oznacz magnetycznie komórki śledziony zgodnie z instrukcją produktu. Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym. Zastosuj zawiesinę komórki z etykietą na kolumnie.

Zbierz przepływ przez wzbogaconą mysią CD osiem plus limfocyty T. Przemyć kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu i połączyć z poprzednim przedmuchem. Wybarwić komórki przeciwciałami anty CD three epsilon i anty CD eight alfa i przeanalizować cytometrię przepływową.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut i ponownie zawieś komórkę do 1 miliona komórek na mililitr w pożywce RPMI z rekombinowanym ludzkim IL dwa. Usunąć roztwór przeciwciała z płytki aktywacyjnej. Przepłukać każdą studzienkę sterylnym PBS.

Dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 5% dwutlenek węgla w inkubatorze komórkowym. Po dwóch dniach produkcji wirusa pożywka w platynowej płytce komórkowej ESE powinna zmienić kolor na żółty.

Przenieś wirusową supinację do 15-mililitrowej stożkowej probówki, aby usunąć resztki komórek. Odwirować supernatant wirusa S w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut. Ostrożnie przenieś supinat wirusa do nowej probówki.

Pozostaw trochę płynu na dnie probówki i nie naruszaj resztek komórek. Zbierz aktywowane limfocyty T z płytki do 50-milimetrowej stożkowej probówki. Określ numer komórki.

Zachowaj kilka komórek w osobnej probówce, która ma być użyta jako wirówka do kontroli ujemnej przy 1000 razy G przez pięć minut i wyrzuć natant leżący na wznak. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w wirusie na wznak. Natant w ilości od 10 do sześciu komórek na mililitr z 20 nanogramami na mililitr rekombinowanego człowieka, interleukiną dwa i 10 mikrogramów na mililitr siarczanu białka.

Dodać jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 24-dołkowej dla probówki kontrolnej. Resus. Zawieś komórki w pożywce RPMI o tej samej gęstości komórek z taką samą ilością rekombinowanego człowieka, interleukiny drugiej i siarczanu białka. Dodaj komórki na tej samej płytce.

Owinąć płytkę wirówką z folii z tworzywa sztucznego przez 90 minut w temperaturze 2000 razy G w temperaturze 32 stopni Celsjusza bez przerwy. Po odwirowaniu usuń folię z tworzywa sztucznego. Dodaj jeden mililitr świeżej pożywki RPMI z 20 nanogramami na mililitr rekombinowanej ludzkiej interleukiny po dwa do każdego, dobrze włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Ważne jest, aby codziennie badać transdukowane limfocyty T. W razie potrzeby podziel komórki w proporcjach od jednego do trzech. Nie pozwól, aby komórki przerosły lub pozwól, aby podłoże zmieniło kolor na żółty w szóstym lub siódmym dniu.

Wybarwić komórki przeciwciałem i tetramerem MHC specyficznym dla TCR, aby ocenić ekspresję TCR na powierzchni komórek T. Użyj komórek T UNSD jako kontrolki. Te transdukowane limfocyty T są teraz gotowe do dalszych zastosowań.

Przed transdukcją wirusa. Korzystne jest uzyskanie podzbiorów limfocytów T o wysokiej czystości przy użyciu komercyjnych kulek magnetycznych w celu oceny poziomu ekspresji TCR na limfocytach T. Można zastosować przeciwciało specyficzne dla łańcuchów TCR alfa lub beta.

Zazwyczaj od 30% do 80% komórek może wyrażać transdukowany TCR w zależności od genów TCR i miana wirusa. Tetramer MHC specyficzny dla TCR może być również używany do dalszej weryfikacji funkcjonalnej ekspresji TCR. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o utrzymaniu komórek w zdrowym stanie Po tej procedurze. Inne metody, takie jak testy cytotoksyczności, kwasu lub uwalniania cytokin, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak specyficzność i czułość transdukcji. Przepisy dotyczące tras postępowania cywilnego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być ekspertem w transdukcji swojego ulubionego TCR do pierwotnych limfocytów T. Do zobaczenia w laboratorium.