Name: Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombinację z markerem wybieralnym galK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę produkcji transgenów w Caenorhabditis elegans przy użyciu rekombinacji lambda red z markerem galK. Technika zachowuje rodzime elementy regulacyjne DNA genomowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Lindsey Nash za pomoc w opracowaniu techniki. Praca ta była finansowana z grantu NIH AG028977 dla A.L.F., grantu na projekt pilotażowy z University of Pittsburgh OAIC (AG024827) oraz środków zakładowych z University of Pittsburgh.

<ol><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-12+encodes+a+nuclear+receptor+that+regulates+the+dauer+diapause+and+developmental+age+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans.</a> Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).</li>
<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
<li>Lehrbach, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN-28+and+the+poly%28U%29+polymerase+PUP-2+regulate+let-7+microRNA+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).</li>
<li>Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+robust+pipeline+for+the+generation+of+fosmid-based+reporter+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans.</a> PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).</li>
<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
<li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li>
<li>Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+pipeline+for+functional+genomics+applied+to+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).</li>
<li>Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+based+modification+in+Escherichia+coli+and+germline+transmission+in+transgenic+mice+of+a+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.</a> Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).</li>
<li>Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+using+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering using homologous recombination.</a> Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).</li>
<li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+MW005%3A+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).</li>
<li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Generowanie transgenów z fosmidów daje korzyść w postaci zachowania wszystkich natywnych elementów promotora, wariantów splicingowych oraz regulacyjnych elementów 3' UTR. Może to prowadzić do skonstruowania transgenu, który w większym stopniu odzwierciedla natywny wzorzec ekspresji, lub do stworzenia funkcjonalnego transgenu w sytuacjach, gdy inne podejścia zawodzą 5. Powstałe transgeny mogą przenosić różne znaczniki epitopowe, w tym GFP lub znacznik TAP.
Konstrukcja transgenów obe...

<table><tbody><tr><td>zestaw FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>pożywka MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>0.132 M roztwór fosforanu potasu</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-deoksygalaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>podłoże agar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja transgenów c. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galk

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Tworzenie zwierząt transgenicznych jest szeroko wykorzystywane w badaniach nad C. elegans, w tym poprzez zastosowanie białek fuzyjnych GFP do badania regulacji i wzorców ekspresji genów docelowych lub generowanie wersji specyficznych genów z tagiem do tandemowej oczyszczania powinowactwem (TAP), aby ułatwić ich izolację. Zazwyczaj transgeny generuje się poprzez umieszczenie promotora powyżej genu reporterowego GFP lub cDNA genu docelowego, co często pozwala uzyskać reprezentatywny wzorzec ekspresji. Jednakże w takim podejściu mogą zostać pominięte krytyczne elementy regulacji genów, takie jak elementy kontrolne w 3' niezakodowanej regionie (UTR) lub promotory alternatywne. Co więcej, metodą tą zazwyczaj można badać tylko jeden wariant splicingowy. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie genomowego DNA nicienia przenoszonego przez klony DNA fosmidów prawdopodobnie obejmuje większość, jeśli nie wszystkie elementy zaangażowane w regulację genów in vivo, co pozwala na dokładniejsze uchwycenie autentycznego wzorca i czasu ekspresji. Aby ułatwić generowanie transgenów przy użyciu DNA fosmidowego, opisujemy procedurę rekombineeringu opartą na E. coli, służącą do wstawiania GFP, tagu TAP lub innych sekwencji docelowych w dowolnym miejscu w genie. Procedura wykorzystuje gen galK jako marker selekcyjny zarówno dla etapu selekcji pozytywnej, jak i negatywnej w rekombineeringu, co pozwala na uzyskanie pożądanej modyfikacji z wysoką wydajnością. Ponadto dostępne są plazmidy zawierające gen galK flankowany ramionami homologii do powszechnie stosowanych genów fuzyjnych GFP i TAP, co redukuje koszt oligosów o 50% podczas generowania białek fuzyjnych GFP lub TAP. Plazmidy te wykorzystują sekwencję startową replikacji R6K, co eliminuje potrzebę rozbudowanego oczyszczania produktów PCR. Na koniec prezentujemy technikę integrowania markera unc-119 z szkieletem fosmidu, co umożliwia bezpośrednie wstrzykiwanie lub bombardowanie fosmidem nicieni w celu wygenerowania zwierząt transgenicznych. Niniejszy film prezentuje procedury generowania transgenu za pomocą rekombineeringu z wykorzystaniem tej metody.

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Tworzenie zwierząt transgenicznych jest powszechnie wykorzystywane w badaniach nad C. elegans, w tym przy użyciu białek fuzyjnych GFP do badania regulacji i ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wygenerowanie transgenów przy użyciu genomowego DNA nicieni zawartego w klonie biblioteki SMID. Wykorzystanie DNA genomowego pozwala na zachowanie wszystkich natywnych elementów kontrolnych, takich jak enhancery w regionach 3' UTR. Osiąga się to poprzez przeniesienie FO smid do szczepu E. coli SW 1 0 6 w celu wykorzystania indukowalnego mechanizmu rekombinacji lambda red.W drugim kroku gen GAL K jest wstawiany w pożądane miejsce w FO smid, co wyznacza miejsce, w którym zostanie umieszczony znacznik GFP lub tap. Następnie gen Gade jest zastępowany przez GFP lub tap TAC poprzez rekombinację homologiczną, po czym następuje selekcja negatywna z użyciem deoxygalaktozy w celu utworzenia zmodyfikowanego transgenu. Uzyskane wyniki wykazują, że transgeny te mogą być tworzone szybko i skutecznie, co potwierdzono weryfikacją wstawienia T za pomocą kolonialnej PCR.Witam, nazywam się Love Ship. Pracuję w laboratorium Fishera na Uniwersytecie w Pittsburghu. Dzisiaj zaprezentuję technikę tworzenia transgenu u C. elegans.Dlaczego stosuje się rekombinację z GK jako marker selekcyjny. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami tworze

the-production-c-elegans-transgenes-via-recombineering-with-galk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja C. elegans transgenów poprzez rekombinowane z selekcyjnym markerem galK

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Poznaj metodę produkcji transgenów w Caenorhabditis elegans przy użyciu rekombinacji lambda red z markerem galK. Technika zachowuje rodzime elementy regulacyjne DNA genomowego.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Przeglądaj więcej filmów