Name: Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombinację z markerem wybieralnym galK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę produkcji transgenów w Caenorhabditis elegans przy użyciu rekombinacji lambda red z markerem galK. Technika zachowuje rodzime elementy regulacyjne DNA genomowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Lindsey Nash za pomoc w opracowaniu techniki. Praca ta była finansowana z grantu NIH AG028977 dla A.L.F., grantu na projekt pilotażowy z University of Pittsburgh OAIC (AG024827) oraz środków zakładowych z University of Pittsburgh.

<ol><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-12+encodes+a+nuclear+receptor+that+regulates+the+dauer+diapause+and+developmental+age+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans.</a> Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).</li>
<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
<li>Lehrbach, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN-28+and+the+poly%28U%29+polymerase+PUP-2+regulate+let-7+microRNA+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).</li>
<li>Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+robust+pipeline+for+the+generation+of+fosmid-based+reporter+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans.</a> PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).</li>
<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
<li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li>
<li>Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+pipeline+for+functional+genomics+applied+to+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).</li>
<li>Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+based+modification+in+Escherichia+coli+and+germline+transmission+in+transgenic+mice+of+a+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.</a> Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).</li>
<li>Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+using+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering using homologous recombination.</a> Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).</li>
<li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+MW005%3A+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).</li>
<li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Generowanie transgenów z fosmidów daje korzyść w postaci zachowania wszystkich natywnych elementów promotora, wariantów splicingowych oraz regulacyjnych elementów 3' UTR. Może to prowadzić do skonstruowania transgenu, który w większym stopniu odzwierciedla natywny wzorzec ekspresji, lub do stworzenia funkcjonalnego transgenu w sytuacjach, gdy inne podejścia zawodzą 5. Powstałe transgeny mogą przenosić różne znaczniki epitopowe, w tym GFP lub znacznik TAP.
Konstrukcja transgenów obe...

<table><tbody><tr><td>zestaw FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>pożywka MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>0.132 M roztwór fosforanu potasu</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-deoksygalaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>podłoże agar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja transgenów c. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galk

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Tworzenie zwierząt transgenicznych jest szeroko wykorzystywane w badaniach nad C. elegans, w tym poprzez zastosowanie białek fuzyjnych GFP do badania regulacji i wzorców ekspresji genów docelowych lub generowanie wersji specyficznych genów z tagiem do tandemowej oczyszczania powinowactwem (TAP), aby ułatwić ich izolację. Zazwyczaj transgeny generuje się poprzez umieszczenie promotora powyżej genu reporterowego GFP lub cDNA genu docelowego, co często pozwala uzyskać reprezentatywny wzorzec ekspresji. Jednakże w takim podejściu mogą zostać pominięte krytyczne elementy regulacji genów, takie jak elementy kontrolne w 3' niezakodowanej regionie (UTR) lub promotory alternatywne. Co więcej, metodą tą zazwyczaj można badać tylko jeden wariant splicingowy. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie genomowego DNA nicienia przenoszonego przez klony DNA fosmidów prawdopodobnie obejmuje większość, jeśli nie wszystkie elementy zaangażowane w regulację genów in vivo, co pozwala na dokładniejsze uchwycenie autentycznego wzorca i czasu ekspresji. Aby ułatwić generowanie transgenów przy użyciu DNA fosmidowego, opisujemy procedurę rekombineeringu opartą na E. coli, służącą do wstawiania GFP, tagu TAP lub innych sekwencji docelowych w dowolnym miejscu w genie. Procedura wykorzystuje gen galK jako marker selekcyjny zarówno dla etapu selekcji pozytywnej, jak i negatywnej w rekombineeringu, co pozwala na uzyskanie pożądanej modyfikacji z wysoką wydajnością. Ponadto dostępne są plazmidy zawierające gen galK flankowany ramionami homologii do powszechnie stosowanych genów fuzyjnych GFP i TAP, co redukuje koszt oligosów o 50% podczas generowania białek fuzyjnych GFP lub TAP. Plazmidy te wykorzystują sekwencję startową replikacji R6K, co eliminuje potrzebę rozbudowanego oczyszczania produktów PCR. Na koniec prezentujemy technikę integrowania markera unc-119 z szkieletem fosmidu, co umożliwia bezpośrednie wstrzykiwanie lub bombardowanie fosmidem nicieni w celu wygenerowania zwierząt transgenicznych. Niniejszy film prezentuje procedury generowania transgenu za pomocą rekombineeringu z wykorzystaniem tej metody.

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Tworzenie zwierząt transgenicznych jest powszechnie wykorzystywane w badaniach nad C. elegans, w tym przy użyciu białek fuzyjnych GFP do badania regulacji i ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wygenerowanie transgenów przy użyciu genomowego DNA nicieni zawartego w klonie biblioteki SMID. Wykorzystanie DNA genomowego pozwala na zachowanie wszystkich natywnych elementów kontrolnych, takich jak enhancery w regionach 3' UTR. Osiąga się to poprzez przeniesienie FO smid do szczepu E. coli SW 1 0 6 w celu wykorzystania indukowalnego mechanizmu rekombinacji lambda red.W drugim kroku gen GAL K jest wstawiany w pożądane miejsce w FO smid, co wyznacza miejsce, w którym zostanie umieszczony znacznik GFP lub tap. Następnie gen Gade jest zastępowany przez GFP lub tap TAC poprzez rekombinację homologiczną, po czym następuje selekcja negatywna z użyciem deoxygalaktozy w celu utworzenia zmodyfikowanego transgenu. Uzyskane wyniki wykazują, że transgeny te mogą być tworzone szybko i skutecznie, co potwierdzono weryfikacją wstawienia T za pomocą kolonialnej PCR.Witam, nazywam się Love Ship. Pracuję w laboratorium Fishera na Uniwersytecie w Pittsburghu. Dzisiaj zaprezentuję technikę tworzenia transgenu u C. elegans.Dlaczego stosuje się rekombinację z GK jako marker selekcyjny. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami tworzenia transgenów Cogan jest to, że wykorzystujemy w niej genomowe DNA interesującego genu, dzięki czemu jesteśmy w stanie objąć wszystkie kluczowe elementy regulacji genu, takie jak elementy kontrolne w regionie 3' UTR, alternatywne transkrypty splicingowe, alternatywne promotory oraz odległe wzmacniacze (enhancery), które mogłyby zostać pominięte w konwencjonalnych podejściach opartych na standardowym klonowaniu. Przejdźmy zatem do szczegółów.Zamów klon FO smid dla interesującego genu (GOI) z serwisu genetycznego, korzystając z WormBase jako przewodnika. Wybierając klony, wybieramy te, w których GOI znajduje się w centrum sekwencji. Preferowane mogą być klony wykluczające sąsiednie geny, jednak znalezienie takiej hodowli może być trudne.Klon SMID dla GOI w pożywce LB zawierającej 12,5 µg/ml chloramfenikolu; klony SMID są dostarczane w szczepie EPI 300 i mogą być hodowane w temperaturze 37 °C. Następnie należy przygotować 1,5 ml kultury nocnej SMID w temperaturze 37 °C i przeprowadzić mini-prep DNA z SMID. Przy użyciu zestawu Epicenter SMID prep stosujemy alternatywny protokół opisany w instrukcji, który polega na dodaniu mieszaniny Ribo shorter na wcześniejszym etapie. Następnie należy oznaczyć stężenie DNA FOSS.Wykorzystanie spektrofotometru wykazuje zazwyczaj bardzo niską, lecz wystarczającą wartość w celu przeprowadzenia udanej elektroporacji. Przygotuj elektrokompetentne komórki SW 1 0 6, hodując przez noc pięć mililitrów kultury w pożywce LB w temperaturze 32 °C w probówce z zakrętką typu snap o pojemności 14 mililitrów.Następnego dnia rano. Zaszczep jeden mililitr hodowli do 100 mililitrów lb w kolbie o pojemności dwóch litrów. Hoduj bakterie SW 1 0 6 do uzyskania OD 600 na poziomie 0,6 do 0,8.Nie stosować szoku termicznego. Odwirować komórki przy 5 000 Gs przez pięć minut. Resuspender osad poprzez delikatne mieszanie w wortexie w jednym mililitrze lodowatego 10% glicerolu.Następnie dodaj 50 mililitrów lodowatego, 10% glicerolu. Powtórz ten etap płukania raz. Na koniec ponownie scentryfuguj SW 1 0 6, aby uzyskać osad i odlej całość poza około 500 mikrolitrów każdego supernatantu Resus.Resuspender osady poprzez delikatne mieszanie na wirówce typu vortex, zamrozić 100 µL aliquotów w ciekłym azocie lub na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu transformacji. Przeprowadzić transformację DNA fosonu do elektrokometentnych komórek SW 106 poprzez elektroporację bakterii z ilością około 50 ng DNA fosonu w kuwetach z przerwą 0,1 cm, używając elektroporatora EOR 2510 przy napięciu 1 350 V. Regenerować bakterie w 1 mL pożywki LB przez jedną godzinę w temperaturze 32 °C, wysiać na płytki LB z chloramfenikolem i inkubować przez noc w temperaturze 32 °C.Zweryfikuj obecność genu docelowego za pomocą colony PCR, hodując kulturę nocną w objętości 5 mL w pożywce LB z dodatkiem 12,5 µg/mL chloramphenicolu w temperaturze 32 °C. Następnie dodaj 0,5 µL kultury do standardowej reakcji PCR z zastosowaniem oligosów flankujących i wydłuż początkową inkubację w 95 °C do pięciu minut, aby zlizować bakterie przed reakcją. Na koniec przygotuj bank glycerolowy do długoterminowego przechowywania, aby wprowadzić gen gal K do wektora pFO smid zawierającego gen docelowy.W pierwszej kolejności przygotuj płytki z minimalnym podłożem MOPS zawierającym 0,2% galaktozy. Przepis znajduje się w pisemnej części niniejszego protokołu. Następnie przeprowadź amplifikację PCR kasety P mod four gal, k, g lub P mod four gal K GT.Stosujemy żel fusion lub go tac. Oczyszczamy otrzymany produkt PCR. Ilość produktu określamy za pomocą żelu lub spektrofotometru NanoDrop.Przechowywać produkt PCR w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia. Zaszczepić pięć mililitrów pożywki z chloramfenikolem komórkami SW 1 0 6 zawierającymi DNA Foss i inkubować przez noc w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Dodać jeden mililitr nocnej hodowli do 100 mililitrów pożywki LB z chloramfenikolem. W kolbie o pojemności dwóch litrów hodować do uzyskania OD od 0,6 do 0,8.Zazwyczaj trwa to od trzech do czterech godzin podczas wzrostu hodowli. Ustawić kołyszącą kąpiel wodną na 42°C i rozgrzać ją, umieszczając w uchwycie sterylną kolbę o pojemności 250 ml. Użycie kołyszącej kąpieli wodnej w kolejnym kroku jest kluczowe dla uzyskania wysokiej wydajności.Następnie przenieś 50 mililitrów kultury SW 1 0 6 do kolby o pojemności 250 mililitrów i przeprowadź szok termiczny w temperaturze 42 °C przy 100 RPM przez dokładnie 20 minut w wytrząsanej kąpieli wodnej. Pozostałe bakterie pozostaw w temperaturze 32 °C, aby posłużyły jako nieindukowana kontrola. Schładzaj bakterie indukowane i nieindukowane na lodzie przez 10 minut.Przenieś próbki do dwóch sterylnych probówek do wirowania i odwiruj przy około 5 000 Gs przez pięć minut. Odlej cały supernatant i resuspenduj osad w jednym mililitrze lodowatego 10% glicerolu, delikatnie mieszając na wortexie. Dodaj kolejne 49 mililitrów lodowatego 10% glicerolu.Powtórz to przemywanie, a następnie ponownie odwiruj osad. Usuń naddestatek, odwracając probówki i zawieś osad w niewielkiej ilości pozostałego płynu Eloqua w próbkach o objętości 100 µL. Zamroź na suchem lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C do następnego dnia.Przeprowadź elektroporację indukowanych i nieindukowanych komórek SW 1 0 6 z zastosowaniem 150 nanogramów przygotowanego produktu PCR, używając kuwet z przerwą 0,1 centymetra w elektroporatorze Bio-Rad Nova 25, ustawionym na 1 350 woltów. Odzyskaj bakterie w jednym mililitrze pożywki LB w probówce Falcon o pojemności 14 mililitrów.Inkubować w temperaturze 32 °C przez cztery i pół godziny, po czym odwirować bakterie z osadu przy 13 200 RPM przez 15 sekund i resuspender w medium M9. Przepis znajduje się w pisemnej części niniejszego protokołu. Powtórzyć ten etap płukania dwukrotnie.Aby usunąć pożywkę bogatą, ponownie odwiruj komórki, a następnie zawieś je w 1 ml M9 przed wysianiem rozcieńczeń seryjnych na pożywkę Mops. Minimalne pożywki inkubuj od 3 do 5 dni w temperaturze 32 °C w inkubatorze. Należy zachować cierpliwość, ponieważ prawdziwie dodatnie klony rosną powoli. Przeciągnij kolonię na agar Macon, aby ją oczyścić i zweryfikować, czy jest GLK-dodatnia.Kolonie powinny zmienić kolor na intensywnie różowy. Wybrać pojedynczą kolonię i zaszczepić ją do 5 mL kultury nocnej w pożywce LB z chloremfenikolem, inkubując w temperaturze 32 °C. Potwierdzić insertację kasety gal w odpowiednim miejscu za pomocą PCR z użyciem starterów flankujących.Należy odnieść się do tabeli 1 w części pisemnej niniejszego protokołu. W przypadku sekwencji oligo, do standardowej reakcji PCR należy dodać 0,5 µL hodowli i wydłużyć początkową inkubację w 95 °C do pięciu minut w celu lizy bakterii. Produkt PCR powinien wykazywać przesunięcie wielkości ze względu na obecność genu GAL K.Na koniec przygotuj zapasy w glicerolu do przechowywania. Przygotuj płytki z minimalnym podłożem MOPS zawierającym 0,2% deoxygalaktozy (DOG) i 0,2% glicerolu. Przepis znajduje się w części opisowej niniejszego protokołu. PCR.Przeprowadź amplifikację fragmentów tagów z PMO 4G FP PBS 1761 lub PBS 1479, stosując te same oligonukleotydy, które zostały użyte w pierwszej rundzie, lub krótsze oligonukleotydy specyficzne dla GFP lub tap. W przypadku tworzenia wielu konstruktów szczególnie przydatne jest zastosowanie krótszych oligonukleotydów, ponieważ ten sam produkt PCR może zostać wykorzystany dla wszystkich konstruktów. Oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie za pomocą żelu lub spektrofotometru. Przygotuj indukowane i nieindukowane kompetentne komórki W 1 0 6 zawierające SMID z genem Gale K zgodnie z wcześniejszym opisem. Przeprowadź elektroporację indukowanych i nieindukowanych komórek SW 1 0 6 za pomocą około 100 nanogramów produktu PCR, wykorzystując kubki gap Q o rozmiarze 0,1 centymetra w elektroporatorze EINOR 25 10 ustawionym na 1 350 voltów.Resuspender w 1 ml LV w probówce z nakrętką typu snap o pojemności 14 ml i inkubować w inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 32 °C przez cztery i pół godziny. Przemyć i rozcieńczyć komórki w M9, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Wysiać bakterie na MOPS, minimalne podłoże zawierające 0,2% DOG i 0,2% glicerolu; inkubować płytki w temperaturze 32 °C przez trzy dni, aby potwierdzić obecność insercji.Użyj czterech kolonii do zaszczepienia pięciomililitrowych kultur nocnych w pożywce LB z dodatkiem 12,5 µg/mL chloramfenikolu; wykonaj PCR kolonii zgodnie z wcześniejszym opisem. Używamy zarówno krótszych oligosów specyficznych dla GFP, jak i oligosów flankujących, aby potwierdzić prawidłowy insert oraz miejsce insercji.GFP ma około 800 par zasad. TAP ma około 550 par zasad, a gal KT 1,4 kilobazy. Na koniec przygotuj zapas glicerolu do długotrwałego przechowywania.Modyfikacja FO smed za pomocą rekombinacji daje stabilne wyniki, a w kroku selekcji negatywnej rutynowo obserwuje się wskaźniki sukcesu przekraczające 90%. Ponadto protokół ten trwa około dwóch tygodni, co pozwala na dość szybkie przygotowanie transgenów, co wykazują 48 kolonii zidentyfikowanych na płytkach DOG i wykorzystanych do PCR kolonii z użyciem starterów flag GFP, które w tym doświadczeniu namnożyły wstawkę GFP. 47 z 48 kolonii jest prawidłowych, a jedna kolonia nie została prawidłowo zmodyfikowana; pokazano 48 kolonii zidentyfikowanych na płytkach DOG i wykorzystanych do PCR kolonii z użyciem starterów flag GFP, które w tym doświadczeniu namnożyły wstawkę GFP.46 z 48 kolonii jest prawidłowych, a dwie kolonie nie zostały prawidłowo zmodyfikowane. Najważniejszą kwestią, o której należy pamiętać podczas wykonywania tego eksperymentu, jest to, że bakterie SW 1 0 6 muszą być hodowane w temperaturze 32 °C, a nie w wyższych temperaturach, ponieważ wzrost w wyższej temperaturze spowoduje wyselekcjonowanie mutantów z mutacjami upośledzającymi mechanizm Lambda red. Życzymy zatem powodzenia w eksperymencie.

the-production-c-elegans-transgenes-via-recombineering-with-galk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja C. elegans transgenów poprzez rekombinowane z selekcyjnym markerem galK

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Poznaj metodę produkcji transgenów w Caenorhabditis elegans przy użyciu rekombinacji lambda red z markerem galK. Technika zachowuje rodzime elementy regulacyjne DNA genomowego.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Przeglądaj więcej filmów