Name: Nukleofekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Poznaj metodę nukleofekcji i hodowli pierwotnych embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgowej myszy. Technika umożliwia badanie wzrostu aksonów, synaptogenezy i dynamiki białek fluorescencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Wisconsin i były zgodne z wytycznymi NIH. Dziękujemy dr Katherine Kalil za udostępnienie urządzenia Nucleofector. Dziękujemy również członkom laboratorium Dent za uwagi do protokołu. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-NS064014, Dana Foundation oraz Whitehall Foundation przyznane E.W.D.
Christopher Viesselmann, Jason Ballweg i Derek Lumbard wnieśli równy wkład w przygotowanie tej pracy.

1. Przygotowanie szkiełek podstawowych i komór
<ol>
<li>Przygotowanie czystych szkiełek nakrywkowych i komór jest niezbędne dla zdrowych kultur. Na żadnym z tych etapów nie należy stosować dróg na skróty.</li>
<li>Myć szkiełka nakrywkowe (okrągłe 12mm lub 22mm, szkło niemieckie - marka Carolina Assistant) przez noc w stężonym kwasie azotowym (HNO3) w dedykowanym słoiku szklanym lub zlewce.</li>
<li>Wyjąć szkiełka nakrywkowe z kwasu azotowego i płukać intensywnie (5-7x) w wodzie dejonizowanej.</li>
<li>Rozdzielić szkiełka nakrywkowe i wysuszyć w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Po wyschnięciu wysterylizować je światłem UV przez 30 minut. Wysterylizowane szkiełka nakrywkowe umieścić w sterylnych szalkach Petriego do przechowywania. W przypadku wysiewania neuronów bezpośrednio na szkiełkach 12mm, umieścić szkiełka w sterylnej szalce 35mm i przejść do Sekcji 2.</li>
<li>Komory do obrazowania konstruuje się poprzez wywiercenie otworu o średnicy 15mm w dnie szalek Petriego 35mm (należy usunąć wszystkie zadziory) i przymocowanie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych za pomocą mieszaniny parafiny i wazeliny w stosunku 3:1.</li>
<li>Roztopić mieszaninę parafiny i wazeliny w probówce stożkowej w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia. Za pomocą małego pędzla pokryć spód szalki wokół otworu 15mm. Należy stale mieszać mieszaninę parafiny i wazeliny, ponieważ ulega ona rozdzieleniu. Prowadzi to zazwyczaj do sklejenia komór z wyższą koncentracją wazeliny, która staje się lepka po umieszczeniu szalek w inkubatorze, co skutkuje odklejeniem się szkiełka nakrywkowego. Pozostałą mieszaninę parafiny i wazeliny można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Umieścić szalkę do góry dnem na płaskiej tacy i położyć szkiełko nakrywkowe nad otworem. Podgrzewać w piecu w temperaturze 80°C, aż mieszanina parafiny się roztopi (~10 minut). Wyjąć szalki na płaską powierzchnię i pozostawić mieszaninę parafiny do zastygnięcia.</li>
<li>Odwrócić szalki i wysterylizować światłem UV zarówno wnętrza nakrywek, jak i dna komór.</li>
<li>Pokryć szkiełka nakrywkowe lub szklane obszary komór roztworem 1.0mg/mL Poly-d-lysine (30kDa) w buforze boranowym (0.1M boran sodu, pH 8.5) przez jedną godzinę. Płukać 3-5 razy obfitymi ilościami dejonizowanej wody klasy do hodowli tkankowych. Należy upewnić się, że usunięto wszystkie ślady buforu boranowego. Wysuszyć i użyć natychmiast lub przechowywać komory/szkiełka nakrywkowe do późniejszego użycia. Zazwyczaj używamy oczyszczonych szkiełek nakrywkowych w ciągu jednego miesiąca od przygotowania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki do mikrodysekcji i hodowli neuronów
<ol>
<li>Przygotować medium do sekcji (DM), dodając odpowiednie ilości 10x HBSS oraz 100X HEPES do wody jakości do hodowli tkankowych. Przechowywać w temperaturze 4°C. Podczas sekcji utrzymywać na lodzie.</li>
<li>Dzień przed sekcją przygotować medium do wysiewu (PM) oraz medium bezsurowicze (SFM). PM składa się z Neurobasal Medium, suplementu B27, 2 mM glutaminy, 0,3% glukozy, 37,5 mM NaCl oraz 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). SFM składa się z Neurobasal Medium, suplementu B27, 2 mM glutaminy, 0,3% glukozy oraz 37,5 mM NaCl.</li>
<li>Przygotować ilość wystarczającą jedynie na potrzeby sekcji i przechowywać przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych z lekko uchylonym zakrętką, aby temperatura i zawartość CO2 w medium uległy wyrównaniu. Dodajemy dodatkową glukozę i zwiększamy osmolalność do około 310mOsm za pomocą NaCl. Stwierdziliśmy, że kultury rozwijają się lepiej przy bardziej fizjologicznej osmolalności (osmolalność Neurobasal wynosi zazwyczaj 205-245mOsm).</li>
</ol>
3. Przygotowanie warstwy pokarmowej komórek glejowych kory do kultur długoterminowych
<ol>
<li>Jeśli planowane jest przygotowanie kultur długoterminowych, należy przeprowadzić tę część protokołu od dwóch do trzech tygodni przed przystąpieniem do wycinków kory mózgowej lub hipokampa.</li>
<li>Przygotować pożywkę glejową (GM) składającą się z MEM, 0,3% glukozy, penicyliny/streptomycyny oraz 10% surowicy konia.</li>
<li>Uśmiercić myszy w wieku P1-P3 poprzez chłodzenie na lodzie przez 5 minut. Wyjąć każde młode z lodu i spryskać 70% etanolem. Szybko odciąć głowę nożyczkami. Przenieść cały mózg do naczynia zawierającego zimne DM (krok 2.1).</li>
<li>Usunąć obie półkule mózgowe oraz opon mózgowo-rdzeniowe. Wyciąć neocortex i przenieść go do nowego naczynia bez pożywki. Przygotować korę z łącznie 4 mózgów.</li>
<li>Rozdrobić korę za pomocą czystego, sterylnego ostrza do golenia tak drobno, jak to możliwe, a następnie przenieść posiekaną tkankę plastikową pipetą do probówki stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej 12 mL zimnego DM. Dodać trypsynę i DNazę do końcowych stężeń odpowiednio 0,25% (1,5 mL) i 0,1% (1,5 mL). Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 10 minut, okresowo delikatnie mieszając zawartość.</li>
<li>Wyjąć probówkę z tkanką korową i dokładnie oczyścić 70% etanolem przed wprowadzeniem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Pipetować tkankę korową w górę i w dół pipetą 10 mL około 10-15 razy lub do momentu zniknięcia większości grudek.</li>
<li>Wrócić probówkę do łaźni wodnej w temperaturze 37°C na kolejne 10 minut, okresowo delikatnie mieszając.</li>
<li>Dokładnie oczyścić probówkę 70% etanolem i ponownie wprowadzić ją do komory z laminarnym przepływem powietrza. Pipetować tkankę korową w górę i w dół pipetą 5 mL około 10-15 razy lub do momentu zniknięcia grudek.</li>
<li>Dodać 15 mL ciepłej pożywki GM i wirować przy 200xg (1000rpm) przez 10 minut.</li>
<li>Odlać nadsącz, resuspendować osad komórkowy w 20 mL świeżej pożywki GM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać 5-7,5x106 komórek w 15 mL GM na kolbę 75cm2.</li>
<li>Po jednym dniu oraz co kolejne 2-3 dni hodowli, usunąć luźne komórki poprzez uderzanie kolbą o dłoń. Odessać pożywkę wraz z usuniętymi komórkami i zastąpić ją 15 mL świeżej GM.</li>
<li>Glej można zebrać po 1-2 tygodniach wzrostu w kolbach, gdy osiągną około 70-100% konfluencji. Aby przygotować pojedyncze szkiełka podstawowe pokryte glejem, umieścić 6 oczyszczonych kwasem azotowym i wysterylizowanych okrągłych szkiełek o średnicy 25mm w naczyniu 10cm; za pomocą małego pędzla nanieść na każde szkiełko 3 kropki mieszaniny parafiny i wazeliny w stosunku 3:1 w układzie trójkąta. Naświetlać otwarte naczynia światłem UV przez 30 minut. Pokryć szkiełka 0,1 mg/mL Poly-d-lysine (30kDa) w buforze boranowym przez jedną godzinę, następnie przemyć obficie (3-5x) sterylną dejonizowaną wodą klasy do hodowli tkankowych i pozostawić do wyschnięcia.</li>
<li>Wyjąć kolbę z glejem z inkubatora, odlać pożywkę i wypłukać 5 mL podgrzanej wcześniej roztworu trypsyny/EDTA. Usunąć roztwór trypsyny/EDTA z kolby i nalać do niej 3 mL świeżego, podgrzanego roztworu trypsyny/EDTA. Inkubować kolbę przez 1 minutę w 37°C przed dodaniem 5 mL GM w celu zatrzymania trypsynizacji.</li>
<li>Zebrać glej z kolby poprzez kilkukrotne pipetowanie (10-15 razy), a następnie przenieść pożywkę do probówki stożkowej 15 mL. Wirować przy 200xg (1000rpm) przez 8 minut. Usunąć nadsącz i dodać 10 mL GM, policzyć komórki i wysiać 5x105 komórek w 12,5 mL GM na naczynie 10cm zawierające szkiełka podstawowe.</li>
<li>Wymieniać pożywkę na świeżą, podgrzaną GM co 2-3 dni. Dzień przed wycinkiem neuronów usunąć GM i zastąpić ją SFM (sekcja 2.2). Tą kondycjonowaną przez glej pożywkę SFM należy wykorzystać w kroku 4.12 podczas zalewania kultur korowych lub hipokampa.</li>
</ol>
4. Wycięcie tkanek z kory i/lub hipokampa oraz elektroporacja
<ol>
<li>Odmierzyć odpowiednie ilości roztworów do nukleofekcji (Lonza), połączyć je i ogrzać do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem sekcji. Ponieważ po zmieszaniu roztwór do nukleofekcji ma ograniczony czas trwałości, łączymy tylko ilość niezbędną dla każdej preparacji (100 μL na transfekcję).</li>
<li>Uśmiercić ciężarną mysz w dniu E15.5 za pomocą CO2 (dzień wystąpienia czopu to E0.5) i przenieść macicę do szalki Petriego o średnicy 10 cm. Wyjąć płody i oddzielić głowy, zanurzając je w zimnym medium DM (rozdział 2.1).</li>
<li>Wyjąć cały mózg do oddzielnej szalki z zimnym medium DM i za pomocą zgiętej igły wolframowej usunąć obie nowokory. Usunąć opony mózgowe mikro pęsetą i umieścić korę w nowej szalce z zimnym medium DM. Za pomocą małych nożyczek irydowych lub nożyczek Weckera wyciąć korę lub hipokamp i umieścić w probówce Eppendorf 1,5 mL wypełnionej 1,0 mL zimnego medium DM. Probówkę przechowywać w lodzie.</li>
<li>Po wysekcjonowaniu wszystkich kory lub hipokampów dodać 110 μL 2,5% trypsyny do probówki Eppendorf zawierającej tkankę i umieścić probówkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 20 minut.</li>
<li>Usunąć nadsącz i wypłukać korę lub hipokampy 1,0 mL medium PM (rozdział 2.2), delikatnie odwracając probówkę Eppendorf. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, pozostawiając w probówce 1 mL medium PM.</li>
<li>Rozbić grudki tkanki poprzez 15-krotne pipetowanie pipetą P1000, a następnie przenieść nadsącz z komórkami do nowej probówki stożkowej 15 mL zawierającej 4 mL medium PM, pozostawiając wszelkie nieprzepracowane grudki w probówce Eppendorf.</li>
<li>Wirować probówkę 15 mL przy 20xg (350rpm) przez 7 minut z wyłączonym hamulcem. Odrzucić nadsącz i dodać 100 μL wymieszanego, w temperaturze pokojowej roztworu do nukleofekcji (Lonza) na każdą transfekcję. Ujednorodnić mieszaninę poprzez 5-krotne, delikatne pipetowanie w górę i w dół pipetą P1000.</li>
<li>Przenieść 100 μL mieszaniny roztworu do nukleofekcji i komórek do każdej nowej probówki Eppendorf i dodać odpowiednią ilość DNA. W przypadku kultur długoterminowych zazwyczaj stosujemy 1-2 μg DNA na transfekcję, jednak pozwala to na oznakowanie jedynie niewielkiej (&lt;10%) części neuronów w kulturze. W celu uzyskania wyższej wydajności transfekcji w kulturach krótkoterminowych stosujemy zazwyczaj 5-10 μg DNA na transfekcję. W przypadku transfekcji dwoma różnymi plazmidami stosowaliśmy łącznie do 40 μg DNA. Plazmidy są przechowywane w buforze TE w stężeniu 1 μg/μL.</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową z DNA do kuwety (Lonza) i przeprowadzić elektroporację komórek w nukleofektorze (Lonza), stosując program O-005 (Mouse CNS neurons).</li>
<li>Szybko dodać 500 μL uprzednio ogrzanego i zrównoważonego medium PM do kuwety, a następnie przenieść roztwór z komórkami do nowej probówki Eppendorf 1,5 mL. Dodać odpowiednią ilość medium PM, aby objętość każdej transfekcji wyniosła 1,0 mL. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i wysiać w zagęszczeniu 3-5x103 komórek/cm2 dla kultur młodych lub 5-10x103 komórek/cm2 dla kultur długoterminowych.</li>
<li>Dla kultur krótkoterminowych, po godzinie od wysiania, wypełnić szalki hodowlane 35 mm 2,0 mL ogrzanego, zrównoważonego z CO2 medium SFM. W przypadku użycia szkiełek podstawkowych usunąć połowę medium PM i zastąpić je medium SFM, a następnie powtórzyć tę czynność dwukrotnie. Zarówno zalanie komór obrazowania, jak i płukanie szkiełek podstawkowych prowadzi do uzyskania bardzo niskiej zawartości surowicy (&lt;0,5%). Kultury krótkoterminowe nie wymagają hodowli z warstwą pokarmową gleju ani ponownego zasilania.</li>
<li>Dla kultur długoterminowych, godzinę po wstępnym wysianiu, wyjmujemy szkiełko podstawkowe pokryte glejem, zawierające trzy kropki parafiny/wazeliny, i odwracamy je nad otworem 15 mm w szalce 35 mm. Następnie do komory obrazowania dodaje się dwa mililitry kondycjonowanego medium SFM z szalki z glejem. Aby zasilać kultury długoterminowe, co 2-3 dni usuwamy jedną trzecią medium SFM i zastępujemy ją świeżym, uprzednio ogrzanym i zrównoważonym z CO2 medium SFM.</li>
</ol> 
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Etapy rozwoju neuronów, mikroskopia fluorescencyjna EGFP-Tubulin DsRed2, schemat, proces komórkowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Żywe neurony hipokampa w kolejnych etapach rozwoju. Przedstawiono pary obrazów reprezentatywnych żywych neuronów hipokampa w formie obrazu z kontrastem różnicowego interferencyjnego oraz odpowiadającego mu mikrografu fluorescencyjnego. Każda z tych komórek została transfektowana EGFP-Tubulin i DsRed2 w wektorach pCAX. Neurony obrazowano w następnych dniach in vitro (DIV): Etap 1 (1DIV), Etap 2 (1DIV), Etap 3 (2DIV), Etap 4 (11DIV) oraz Etap 5 (32DIV). Pasek skali wynosi 20μm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół hodowli embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgu myszy został opracowany jako modyfikacja protokołu Bankera, w którym wykorzystywano neurony szczura1,2. Stosowaliśmy ten protokół również do hodowli neuronów myszy i chomika3,4,5,6,7. Protokół ten sprawdza się równie dobrze w przypadku neuronów hipokampa, jak i neuronów nowokory, i jest podobny do protokołu opublikowanego przez Meberga i Millera8. Zazwyczaj do hodowli długoterminowych wykorzystujemy neurony hipokampa, ponieważ są one dobrze scharakteryzowane i stanowią bardziej ugruntowany system modelowy. Co więcej, prawdopodobnie zawierają one bardziej jednorodną populację neuronów niż nowokora. Jednakże neurony nowokory hodowane według tego protokołu również przeżywają i różnicują się w podobny sposób (dane nieopublikowane). Rutynowo wykorzystujemy neurony hipokampa i nowokory do hodowli krótkoterminowych. Wypreparowanie nowokory pozwala również na uzyskanie znacznie większej liczby neuronów (1,5x106 neuronów na parę kory) niż w przypadku hipokampa (2,5x105 neuronów na parę hipokampów), co czyni ten materiał lepszym wyborem, na przykład do analizy Western blotting.
Podobnie jak w przypadku każdej hodowli pierwotnej, kluczowe jest zminimalizowanie czasu od śmierci zwierzęcia do wysiania komórek. Zazwyczaj potrzeba od 10 do 20 sekcji, aby osiągnąć stałą biegłość w przeprowadzaniu sekcji i wysiewania. Ponadto, podczas pracy z systemem Lonza Nucleofector, niezwykle ważne jest szybkie działanie podczas procedury elektroporacji, ponieważ żywotność neuronów gwałtownie spada, jeśli pozostaną one w buforze do nukleofekcji.
Większość naszych obrazowań przeprowadzana jest za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM). Ten rodzaj mikroskopii umożliwia obrazowanie jedynie obszaru o grubości kilkuset nanometrów poza szkiełkiem podstawowym. W związku z tym obszary neuronów, które najczęściej obrazujemy – stożki wzrostu aksonów i kolce dendrytyczne – muszą przylegać bezpośrednio do szkiełka. Stosujemy zatem hodowle o niskiej gęstości, które do długoterminowej hodowli wymagają obecności komórek glejowych jako warstwy odżywczej. W przypadku hodowli długoterminowych wykorzystywaliśmy również hodowle o wyższej gęstości (>2x104 komórek/cm2) bez warstw odżywczych komórek glejowych i stwierdzono, że przeżywają one bardzo dobrze przy minimalnym dokarmianiu. Jednak kolce dendrytyczne tych neuronów często znajdują się zbyt daleko od podłoża, aby można je było obrazować w technice TIRFM, mimo że można je łatwo wykryć za pomocą mikroskopii szerokopolowej lub mikroskopii konfokalnej.
W większości naszych badań przeprowadzamy transfekcję neuronów przed wysianiem, a obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie prowadziliśmy przez okres do trzech miesięcy hodowli. Ta długotrwała ekspresja białek znakowanych fluorescencyjnie daje nam pewność, że stosując niskie stężenia DNA (1-2μg) nie wywołujemy artefaktów związanych z nadekspresją w neuronach. Procedura ta może być jednak wykorzystana również do badania nadekspresji białek, jeśli zastosowane zostaną duże ilości DNA (10-20μg). Plazmidy, których używamy do transfekcji neuronów, zazwyczaj zawierają białka fuzyjne EGFP lub mCherry, choć znakujemy również cytoplazmę neuronów samym DsRed2 lub EGFP. Ta technika elektroporacji działa dobrze z wieloma wektorami. Preferujemy plazmidy zawierające promotor β-aktyny z enhancerem CMV i ogonem poly-A β-globiny (plazmidy pCAGGs lub pCAX)9, ze względu na stosunkowo wysokie poziomy ekspresji oraz fakt, że są one dobrze tolerowane przez neurony zarówno w hodowlach krótkoterminowych, jak i długoterminowych. Zazwyczaj białka zaczynają się eksponować w ciągu około 4 godzin od wysiania i osiągają poziomy wystarczające do obrazowania w ciągu 10-24hrs10. Z powodzeniem stosowaliśmy plazmidy sterowane promotorem CMV w hodowlach krótkoterminowych, jednak stwierdziliśmy, że mogą one powodować wysoką nadekspresję, która prowadzi do śmierci neuronów w hodowli długoterminowej. Niemniej jednak zauważyliśmy, że kondycjonowanie glejowe kultur o niskiej gęstości wspomaga przeżywalność neuronów przetransfekowanych plazmidami sterowanymi promotorem CMV w porównaniu do kultur o większej gęstości (niewspomaganych glejem).

<table><tbody><tr><td>Boran sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93356</td><td>Przechowywać bufor boranowy w temperaturze pokojowej (RT).</td></tr><tr><td>Poli-d-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886-100mg</td><td>Rozpuścić w 0.1M buforze boranowym. Przefiltrować sterylnie i przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Trypsyna (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>Przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>DNaza (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td>Przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095-080</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>Przechowywać w RT.</td></tr><tr><td>HEPES (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Hyclone</td><td>SH3007403</td><td>Przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Neurobasal E (NB)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Suplement B27 (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Glutamina (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>Przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>30% glukozy w NB (100X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td>Rozpuścić glukozę w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>3.75M NaCl w NB (100X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Rozpuścić NaCl w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3007003</td><td>Przechowywać alikwoty w -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Parafina/Wazelina (3:1 m/m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Parafina &amp;#8211; P31-500 Wazelina &amp;#8211; P66-1</td><td>Połączyć w probówce stożkowej i roztopić w wrzącej wodzie.</td></tr><tr><td>Stężony kwas azotowy (HNO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A509-212</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej. Można używać wielokrotnie. Wyrzucić w przypadku zażółcenia.</td></tr><tr><td>5mM chlorowodorek cytozyna &amp;#8211;β-D-arabinofuranosydy (AraC) w NB (1000X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645</td><td>Rozpuścić AraC w NB i przefiltrować sterylnie. Przechowywać w -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_conent">*Większość odczynników przechowywanych w -80&amp;#x00B0;C można przechowywać również w -20&amp;#x00B0;C. Przechowywanie ich w -80&amp;#x00B0;C wydłuża ich okres trwałości i pozwala uzyskać nieco bardziej spójne kultury.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Neurony hipokampa i kory mózgu są szeroko wykorzystywane do badania polaryzacji neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN), wzrostu aksonów i dendrytów oraz tworzenia i funkcjonowania synaps. Zaletą hodowli tych neuronów jest to, że ulegają one łatwej polaryzacji, tworząc wyraźne aksony i dendryty na podłożu dwuwymiarowym przy bardzo niskiej gęstości. Właściwość ta sprawiła, że są one niezwykle przydatne do określania wielu aspektów rozwoju neuronów. Ponadto, poprzez zapewnienie tym neuronom kondycjonowania glejowego, będą one nadal się rozwijać, tworząc funkcjonalne połączenia synaptyczne i przeżywając w hodowli przez kilka miesięcy. W niniejszym protokole opisujemy technikę izolacji, hodowli i transfekcji embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Transfekcja jest realizowana poprzez elektroporację DNA do neuronów przed wysiewem za pomocą nukleofekcji. Protokół ten ma tę zaletę, że pozwala na ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie we wczesnej fazie rozwoju (~4-8 h po wysiewie), co umożliwia badanie dynamiki i funkcji białek podczas polaryzacji, wzrostu aksonów i ich rozgałęziania. Odkryliśmy również, że ta jednorazowa transfekcja przed wysiewem utrzymuje ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie na poziomach odpowiednich do obrazowania przez cały okres życia neuronu (&gt; 2 miesiące w hodowli). Zatem metodologia ta jest przydatna do badania lokalizacji i funkcji białek w trakcie rozwoju OUN przy niewielkim lub braku zaburzeń funkcji neuronalnych.

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Neurony hipokampa i kory mózgu były szeroko wykorzystywane do badania polaryzacji neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN), wzrostu aksonów/dendrytów oraz ...

Neurony hipokampa i kory mózgu są szeroko wykorzystywane do badania polaryzacji neuronów ośrodkowego układu nerwowego, wzrostu aksonów i dendrytów oraz powstawania i funkcji synaps; zaletą hodowli tych neuronów jest to, że łatwo ulegają one polaryzacji, tworząc charakterystyczne aksony i dendryty na podłożu dwuwymiarowym przy bardzo niskich gęstościach. Niniejszy materiał wideo prezentuje technikę wyizolowania, hodowli i transfekcji embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy za pomocą nukleofekcji, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie we wczesnej fazie rozwoju, około od czterech do ośmiu godzin po wysianiu. Ekspresja białek znakowanych fluorescencyjnie jest utrzymywana przez cały okres życia neuronu, przez ponad dwa miesiące hodowli. Pozwala to na badanie funkcji białek podczas wczesnych zdarzeń rozwojowych, takich jak wzrost aksonów, oraz późniejszych etapów, takich jak synaptogeneza i plastyczność synaptyczna.W pierwszej kolejności komórki glejowe izoluje się z półkul korowych myszy w pierwszym do trzeciego dniu po urodzeniu, a następnie wysiewa do kolb. Po osiągnięciu konfluencji na poziomie od 70 do 100%, komórki glejowe są przesiewane na szklane kryszalki.Następnie z myszy w stadium E 15.5 izoluje się neurony hipokampa lub kory mózgowej i poddaje je transfekcji metodą nucleofekcji plazmidami kodującymi fluorescencyjne białka fuzyjne, takie jak czerwone białko fluorescencyjne. Transfekowane neurony wysiewa się następnie do komór obrazujących w celu przeprowadzenia badań krótkoterminowych. W przypadku kultur długoterminowych, komórki glejowe na szkiełkach podstawkowych odwraca się nad kulturami hipokampa lub kory w celu zapewnienia wsparcia troficznego; następnie można obrazować poszczególne neurony, aby ukazać dynamiczną lokalizację białek fuzyjnych w aksonach lub dendrytach neuronów.Witam, jestem Eric Dent, profesor pomocniczy anatomii na University of Wisconsin Madison. Dzisiaj troje moich studentów studiów licencjackich, Chris Wezelman, Jason Bwe i Derek Lombard, zademonstruje procedurę izolacji, wysiewania i utrzymywania kultur neuronów korowych i hipokampalnych w krótkoterminowych i długoterminowych kulturach. Kultury te mogą być wykorzystywane do badania dynamiki fluorescencyjnych białek fuzyjnych w trakcie rozwoju neuronalnego, od początkowego wzrostu neurytów, poprzez rozwój aksonów i dendrytów, aż po synaptogenezę.Aby przygotować komory do obrazowania, należy użyć embrionalnych neuronów hipokampa i kory mysiej. Należy rozpocząć od 35 milimetrowych szalek Petriego z wywierconymi w dnie otworami o średnicy 15 milimetrów, po usunięciu wszystkich wiórów. Roztopić mieszaninę parafiny i wazeliny w stosunku trzy do jednego w probówce stożkowej, umieszczając ją w łaźni wodnej z wrzącą wodą.Następnie za pomocą małego pędzla pokryć spód szalki wokół otworu. Należy pamiętać o wymieszaniu parafiny z wazeliną pomiędzy aplikacjami do kolejnych komór, ponieważ składniki te mają tendencję do rozwarstwiania się. Na otwór nałożyć szkiełko nakrywki.Po przygotowaniu wszystkich szalek należy umieścić je w piekarniku nagrzanym do 80 °C, aż mieszanina parafiny się rozpuści. Powinno to zająć około 10 minut. Następnie należy wyjąć szalki, położyć je na płaskiej powierzchni i pozostawić mieszaninę parafiny do zastygnięcia na co najmniej jedną minutę.Odwróć szalki i umieść je pod wyciągiem. Włącz lampę UV na 30 minut, aby wysterylizować zarówno wewnętrzne strony pokrywek, jak i dna komór. Następnie przejdź do powlekania.Okładki komory pokrywa się poli-D-lizyną na jedną godzinę. Następnie pokrywki z powłoką należy dokładnie wypłukać od trzech do pięciu razy sterylną odfiltrowaną wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie ślady buforu borowego. Po ostatnim płukaniu komory należy osuszyć za pomocą pompy próżniowej. Mogą one zostać użyte natychmiast lub przechowywane w pomieszczeniu do hodowli tkankowej do późniejszego użycia.Powlekane komory powinny zostać użyte w ciągu jednego tygodnia od przygotowania, jeśli planowane są hodowle długoterminowe. Warstwy pokarmowe gleju korowego należy przygotować od dwóch do trzech tygodni przed przystąpieniem do wycinania fragmentów kory lub hipokampa. Mózgi czterech myszy z miotu P1 do P3 należy umieścić w naczyniu zawierającym zimne medium do mikrodysekcji i ustawić pod mikroskopem dissectingowym.Usuń opłaty węchowe, obie półkule mózgu oraz opony mózgowe. Przenieś półkule do nowej szalki niezawierającej pożywki. Używając czystego, sterylnego ostrza brzytwy, rozdrobnij korę mózgową tak drobno, jak to możliwe.Następnie za pomocą plastikowej pipety przenieś posiekaną tkankę do 50 mililitrowej probówki stożkowej zawierającej 12 mililitrów zimnego Medium do sekcji. Dodaj trypsynę i DNase do końcowych stężeń odpowiednio 0,25% i 0,1%. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, okresowo delikatnie mieszając zawiesinę.Po inkubacji wyjmij probówkę z kąpieli wodnej i dokładnie oczyść ją 70% etanolem przed przeniesieniem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Pipetuj tkankę kory w górę i w dół.Za pomocą pipety 10 ml odessaj zawartość około 10 do 15 razy lub do momentu zniknięcia większości grudek, a następnie przenieś probówkę z powrotem do kąpieli wodnej na kolejne 10 minut, okresowo delikatnie nią potrząsając. Ponownie dokładnie oczyść probówkę 70% etanolem i przenieś ją z powrotem pod dygestorium do hodowli tkanek.Pipetuj tkankę kory góra-dół. Podobnie jak poprzednio, tym razem używając pipety pięciomililitrowej, dodaj 15 ml ciepłego medium glialnego i wiruj przy 1000 RPM przez 10 minut. Odlej supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 20 ml świeżego medium glialnego.Użyj komory countingowej (hemo-cytometru) do policzenia komórek. Następnie wysiej od 5 do 7,5 miliona komórek w 15 mililitrach pożywki glejowej na kolbę o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza; po jednym dniu oraz co dwa do trzech kolejnych dni hodowli usuwaj luźne komórki, uderzając kolbą o powierzchnię dygestorium.Usuń pożywkę wraz z wszelkimi oderwanymi komórkami i zastąp ją 15 mililitrami świeżego pożywki dla gleju. Glej można zebrać po jednym do dwóch tygodniach wzrostu w kolbach, gdy osiągną one około 100% konfluencji. Aby przygotować pojedyncze szkiełka podstawowe pokryte glejem, zacznij od umieszczenia sześciu oczyszczonych kwasem azotowym i wysterylizowanych.Umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm w szalce 10 cm i za pomocą małego pędzla nanieść trzy kropki mieszaniny wazeliny parafinowej w proporcji 3:1 na każde szkiełko, tworząc wzór trójkąta. Na krawędziach szkiełka nakrywkowego nanieść dwie kropki, aby przymocować je do szalki.Naświetlaj otwarte szalki promieniami UV przez 30 minut. Pokryj szkiełka nakrywkowe poli-D-lizyną i pozostaw na jedną godzinę. Następnie płucz dokładnie od trzech do pięciu razy sterylną, filtrowaną wodą dejonizowaną, pozostaw do wyschnięcia i wyjmij komórki glejowe z inkubatora.Odessać medium i przemyć pięcioma mililitrami podgrzanej wcześniej trypsyny. Dodać trzy mililitry trypsyny do kolby i inkubować przez jedną minutę w temperaturze 37 °C. Po odklejeniu się komórek dodać pięć mililitrów medium glejowego, aby zatrzymać działanie trypsyny.Usuń GL z kolby, pipetując ciecz w górę i w dół od 10 do 15 razy. Następnie przenieś medium do 15-mililitrowej probówki stożkowej i wiruj przy 1000 RPM przez osiem minut. Po odwirowaniu osadu zawieś komórki w 10 mililitrach medium dla gleju.Następnie, po policzeniu komórek, wysiej 5 × 10⁵ komórek w 12,5 ml pożywki glialnej na płytkę 10 cm zawierającą szkiełka podstawowe. Wymieniaj pożywkę na świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę glialną co dwa do trzech dni, aż do dnia poprzedzającego wyizolowanie neuronów. Usuń pożywkę glialną i zastąp ją pożywką bezsurowiczą.Użyj tego medium bezsurowiczego do kondycjonowania glejowego w późniejszym etapie. Podczas zalewania kultur korowych lub hipokampalnych dodaje się C do stężenia końcowego 5 µM. Aby zapobiec proliferacji gleju, użyj odczynników do transfekcji nukleowej zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie ogrzej roztwór do temperatury pokojowej.Umieść naczynie zawierające mózgi myszy w stadium E 15.5 w zimnym medium do mikrodysekcji. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą zgiętej igły wolframowej, usuń obie korory nowej. Następnie, używając mikropincety, usuń opony mózgowe i przenieś korę do nowego naczynia z zimnym medium do mikrodysekcji.Hipokamp i kora są widoczne wzdłuż strony przyśrodkowej półkuli mózgu; użyj małych nożyczek irydologicznych. Ostrożnie usuń hipokamp. Następnie usuń pozostałą część kory.Powtórz sekcję mózgów wszystkich osobników z miotu. Umieść korę hipokampa w oddzielnych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra wypełnionych jednym mililitrem zimnego medium sekcyjnego. Umieść probówki na lodzie po wycięciu wszystkich obszarów kory i hipokampów.Dodaj 110 µL 2,5% trypsyny do probówek typu microfuge zawierających tkankę i umieść probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 minut. Za pomocą pipety P 1000 usuń z probówki jak najwięcej płynu. Następnie dodaj 1 mL medium hodowlanego do każdej probówki i przemyj tkankę, delikatnie odwracając probówkę.Powtórz płukanie dwukrotnie. Po ostatnim płukaniu dodaj 1 ml medium do wysiewu. Za pomocą pipety P 1000 potryturuj fragmenty tkanki 15 razy. Następnie przenieś nadsącz wraz z komórkami do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml medium do wysiewu, pozostawiając wszelkie pozostałe fragmenty tkanki w probówce do wirówki.Wiruj probówkę o pojemności 15 ml przy 350 RPM przez siedem minut z wyłączonym hamulcem po zakończeniu wirowania, odlej nadsącz i dodaj 100 µl uprzednio przygotowanego w temperaturze pokojowej roztworu do nuklefekcji dla każdej transfekcji; pipetuj w górę i w dół pięć razy w celu wymieszania, następnie przenieś 100 µl mieszaniny roztworu do nuklefekcji i komórek do każdej nowej probówki do wirówki zawierającej odpowiednią ilość DNA; 1 do 2 µg DNA na transfekcję dla kultur długoterminowych oznakuje mniej niż 10% neuronów w kulturze.Podczas gdy zastosowanie od 5 do 10 µg DNA na jedną transfekcję zapewni wyższą wydajność transfekcji w hodowli, należy dodać zawiesinę komórkową i mieszankę DNA do kuwety do elektroporacji. Następnie umieść kuwetę w elektroporatorze. W przypadku neuronów OUN myszy ustaw program nucleo effector na 0 0 5; działając szybko, dodaj 500 µL uprzednio ogrzanej i wyrównanej temperatury pożywki do wysiewu do kuwety, a następnie przenieś roztwór komórkowy do nowej probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml.Dodać wystarczającą ilość pożywki do wysiewu, aby objętość każdej transfekcji wyniosła 1 mL. Po policzeniu komórek, wysiać od 3 do 5 × 10³ komórek/cm² w przypadku kultur krótkoterminowych lub od 5 do 10 × 10³ komórek/cm² dla kultur długoterminowych; zazwyczaj do przygotowania kultur krótkoterminowych stosuje się od 5 × 10⁵ do 1 × 10⁶ komórek na transfekcję.Godzinę po wysianiu wypełnij 35 milimetrowe płytki hodowlane dwiema mililitrami ciepłego, nasyconego dwutlenkiem węgla medium bezsurowiczego. Komory obrazowania zapewniają bardzo niską zawartość surowicy, poniżej 0,5%. Hodowle krótkoterminowe nie wymagają hodowania z warstwą pokarmową gleju ani ponownego wysiewania. Aby przygotować hodowle długoterminowe, dodaj jeden mililitr kondycjonatu glialnego do medium bezsurowiczego.Zdejmij szkiełko nakrywkowe GL zawierające trzy kropelki wazeliny petyrolatycznej i odwróć je nad otworem o średnicy 15 mm w szalce 35 mm. Następnie dodaj kolejny 1 ml pożywki, aby odżywić kultury długoterminowe. Wymieniaj jedną trzecią pożywki bez surowicy co dwa do trzech dni.Po pięciu do siedmiu dniach hodowli dodaje się cytozynę arabinozyd (Ara-C) do stężenia końcowego 5 µM w celu zapobiegania proliferacji gleju. Poniższe zestawione obrazy reprezentatywnych żywych neuronów hipokampa przedstawiają zarówno obraz w kontraście interferencyjnym różnicowym, jak i odpowiadający mu mikrograf fluorescencyjny. Każda z tych komórek została przetransfekowana wektorami pA kodującymi EGFP, tubulinę oraz DsRed2.W fazie pierwszej neurony początkowo przylegają do podłoża, a w ciągu około jednego dnia wytwarzają w obrębie obwodu ciała komórki płaskie lamellipodia oraz palczaste filopodia. W fazie drugiej pierwotne wypustki różnicują się w kilka neurytów wyrastających z ciała komórki, które zazwyczaj zachowują długość od 30 do 50 µm. W fazie trzeciej, w sposób stochastyczny, jeden z neurytów zaczyna gwałtownie wydłużać się, przekształcając się w akson.Pozostałe neuryty pozostają krótkie i nazywane są wypustkami pobocznymi. Większość neuronów hipokampa i kory dotarła do etapu trzeciego w ciągu dwóch do trzech dni hodowli; podczas etapu czwartego, który trwa przez kolejny tydzień lub dwa, wypustki poboczne grubieją, wydłużają się i rozgałęziają, przekształcając się w dendryty, tutaj pokazane na zielono. W międzyczasie akson cieńczeje w miarę dalszego wzrostu i rozgałęziania się do drugiego lub trzeciego tygodnia.W hodowli dendryty różnicują się poprzez tworzenie kolców dendrytycznych, czyli małych wypustek wzdłuż dendrytów. Neurony w piątym stadium będą różnić się kształtem i rozmiarem, jednak większość z nich powinna przejść przez tę serię etapów rozwojowych. Neurony przetransfekowane mogą nie przechodzić przez te stadia, jeśli nadekspresja białek zaburzy rozwój neuronalny.Ponadto neurony mogą nie przejść przez wszystkie etapy rozwoju. Jeśli szkiełka zakrywa nie zostaną odpowiednio oczyszczone lub polilizyna nie przylgnie prawidłowo, może dojść również do intensywnej proliferacji gleju, zwłaszcza jeśli nie zostanie użyty C. Jest to obraz w kontraście fazowym dwutygodniowej hodowli, w której w hodowlach długoterminowych glej przerósł kulturę.Zbyt częsta lub zbyt rzadka wymiana pożywki może również negatywnie wpłynąć na żywotność neuronów. Jest to obraz w kontraście fazowym hodowli, w której większość neuronów obumarła, a pozostałe neurony mają skurczone ciała komórkowe i paciorkowate wypustki. Dla porównania, tutaj znajduje się obraz w kontraście fazowych zdrowych neuronów hipokampa po dwóch tygodniach hodowli. Zwróć uwagę na większe ciała komórkowe oraz brak paciorkowania w wypustkach.Ponadto na tym etapie wypustki dendrytyczne uległy pogrubieniu, a wypustki aksonalne tworzą rozległą siatkę. Po opanowaniu tej techniki, preparatyka embrionalna, korowa i sekcja, a także transfekcja i wysiew całego miotu płodów mogą zostać wykonane w ciągu dwóch godzin, jeśli procedura jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że neurony hipokampa i kory są bardzo wrażliwe na uszkodzenia mechaniczne.Ważne jest również, aby podczas izolacji neuronów utrzymywać roztwory w jak najniższej temperaturze, aby zminimalizować aktywność metaboliczną. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek oraz fizjologiczne rejestrowanie aktywności, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób fluorescencyjne białka fuzyjne budzące zainteresowanie segregują się do różnych obszarów neuronu. Pozwala to również zbadać, czy lokalizacja białek jest powiązana ze zmianami w aktywności synaptycznej oraz w jaki sposób funkcje tych białek są modyfikowane przez różne zabiegi farmakologiczne.

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nukleofekcja i pierwotna kultura zarodkowych neuronów hipokampalnych i korowych myszy

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Przedstawiamy protokół hodowli wysoko oczyszczonych neuronów hipokampa z prenatalnych mózgów myszy bez użycia warstwy komórek glejowych jako komórek zasilających.

Izolacja i hodowla neuronów hipokampa z myszy prenatalnych

Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół

Poprzez znakowanie domen pozakomórkowych receptorów błonowych za pomocą superecliptic pHluorin oraz obrazowanie tych receptorów fuzyjnych w hodowlanych neuronach mysich, możemy bezpośrednio wizualizować pojedyncze zdarzenia wbudowywania pęcherzyków z receptorami w błonę plazmatyczną. Technika ta będzie miała kluczowe znaczenie w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów sterujących wbudowywaniem receptorów w błonę plazmatyczną.

Obrazowanie wbudowywania receptorów znakowanych pHluoriną w błonę plazmatyczną w pierwotnych kulturach neuronów mysich

Film demonstruje metodę hodowli neuronów z mysich hipokampów. Początkowo hipokampy przechodzą trawienie enzymatyczne w celu rozbicia zewnątrzkomórkowej macierzy tkankowej. Następnie strawiona tkanka jest mechanicznie rozrywana w celu wyizolowania pojedynczych neuronów. Wreszcie, neurony te są hodowane na komórkach glejowych.

Technika hodowli neuronów hipokampa myszy

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Tutaj opisaliśmy protokół ilościowego badania montażu i struktury początkowych segmentów aksonów (AIS) neuronów hipokampa, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS z powodu braku gigantycznej ankyryny-G.

Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Poznaj metodę nukleofekcji i hodowli pierwotnych embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgowej myszy. Technika umożliwia badanie wzrostu aksonów, synaptogenezy i dynamiki białek fluorescencyjnych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Przeglądaj więcej filmów