Nukleofekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory mózgowej myszy

Neurony hipokampa i kory mózgowej były szeroko wykorzystywane do badania polaryzacji neuronów ośrodkowego układu nerwowego, wzrostu dendrytów aksonów oraz tworzenia i funkcji synaps, a zaletą hodowli tych neuronów jest to, że łatwo polaryzują się, tworząc charakterystyczne aksony i dendryty na dwuwymiarowym podłożu o bardzo niskiej gęstości. Ten film demonstruje technikę analizy kultury i transfekcyjnych, embrionalnych, mysich neuronów hipokampa i kory mózgowej za pomocą pobudzenia jądra, co umożliwia ekspresję fluorescencyjnie znakowanych białek fuzyjnych na wczesnym etapie rozwoju około czterech do ośmiu godzin po posiewie, ekspresja fluorescencyjnie znakowanych białek jest utrzymywana przez całe życie neuronu przez ponad dwa miesiące w hodowli. Umożliwia to badanie funkcji białek podczas wczesnych zdarzeń rozwojowych, takich jak rozrost aksonów, oraz późniejszych zdarzeń, takich jak synaptogeneza i plastyczność synaptyczna.

Najpierw komórki glejowe są izolowane z półkul korowych po urodzeniu. Dzień pierwszy do trzech myszy wyskakują i platerowane do kolb. Po osiągnięciu płynności od 70 do 100% CO, komórki glejowe są następnie ponownie powlekane na szklanych szkiełkach nakrywkowych.

Następnie neurony hipokampa lub kory mózgowej są izolowane od myszy E 15,5 i transfekowane przez uczucie jądra plazmidami kodującymi fluorescencyjne białka fuzyjne, takie jak białko czerwonej fluorescencji. Transfekowane neurony są następnie umieszczane w komorach obrazowania w celu przeprowadzenia krótkoterminowych badań. W przypadku hodowli długoterminowych komórki glejowe na szklanych szkiełkach nakrywkowych są odwracane nad kulturami hipokampa lub kory mózgowej Aby zapewnić wsparcie troficzne, można następnie zobrazować poszczególne neurony, aby pokazać dynamiczną lokalizację białek fuzyjnych w aksonach lub dendrytach neuronów.

Cześć, nazywam się Eric Dent i jestem adiunktem anatomii na Uniwersytecie Wisconsin w Madison. Dzisiaj trzej moi studenci, Chris Wezelman, Jason Bwe i Derek Lombard, zademonstrują procedurę izolowania posiewu i utrzymywania kultur neuronów korowych i hipokampowych w celu hodowli krótko- i długoterminowej. Kultury te można wykorzystać do badania dynamiki fluorescencyjnych białek fuzyjnych w całym rozwoju neuronalnym, od początkowego wzrostu neurytów, poprzez rozwój aksonów i dendrytów, aż po synaptogenezę.

Aby przygotować komory do obrazowania, embrionalne, mysie neurony hipokampa i korowe. Zacznij od 35-milimetrowych szalek Petriego z 15-milimetrowymi otworami wywierconymi w dnie i usuniętymi wszystkimi wiertłami. Topi mieszaninę wazeliny parafinowej w proporcji trzy do jednego w stożkowej probówce, umieszczając ją we wrzącej łaźni wodnej.

Następnie za pomocą małego pędzla pokryj spód naczynia wokół otworu. Pamiętaj, aby wymieszać mieszaninę wazeliny parafinowej między komorami, ponieważ się rozdzieli. Umieść szkiełko nakrywkowe na otworze.

Gdy wszystkie potrawy zostaną przygotowane, wstaw je do piekarnika o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż mieszanina parafinowa się rozpuści. Powinno to zająć około 10 minut. Następnie wyjmij naczynia na płaską powierzchnię i pozwól mieszaninie parafiny zastygnąć przez co najmniej jedną minutę.

Odwróć naczynia i umieść je pod okapem. Włącz światło UV na 30 minut, aby wysterylizować zarówno wnętrze pokryw, jak i dna komór. Następny płaszcz.

Pokrywa komory nasunięta jest lycyną poly D przez jedną godzinę. Następnie dokładnie spłucz powlekane szkiełka nakrywkowe trzy do pięciu razy sterylną wodą dejonizowaną z filtrem, aby usunąć wszelkie ślady bufora otworu Po ostatnim płukaniu użyj odkurzacza do wysuszenia komór. Można je wykorzystać natychmiast lub przechowywać w pomieszczeniu do hodowli tkankowych na później. Używać.

Komory powlekane należy zużyć w ciągu tygodnia od przygotowania, jeśli będą przygotowywane hodowle długotrwałe. Warstwy zasilające korę glejową będą musiały zostać rozpoczęte dwa do trzech tygodni przed kontynuowaniem rozwarstwień kory mózgowej lub hipokampa. Umieść mózgi czterech P jeden do P trzech mysich popów w naczyniu zawierającym zimne podłoże preparacyjne i umieść je pod lunetą sekcyjną.

Usuń opuszki węchowe, dwie półkule mózgowe i opony mózgowe. Przenieś półkule do nowego naczynia bez pożywki. Używając czystej, sterylnej żyletki, zmiel korę tak drobno, jak to możliwe.

Następnie za pomocą plastikowej pipety przenieś posiekaną tkankę do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 12 mililitrów zimnego rozwarstwienia. Średni. Dodaj trypsynę i DNA do końcowych stężeń odpowiednio 0,25% i 0,1%. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut z przerywanym wirowaniem.

Po inkubacji wyjmij probówkę z łaźni wodnej i dokładnie oczyść ją 70% etanolem przed wprowadzeniem do tkanki. Kaptur kulturowy. Pipetuj tkankę korową w górę iw dół.

Za pomocą 10-mililitrowej pipety około 10 do 15 razy lub do momentu, gdy większość kawałków zniknie, włóż probówkę z powrotem do łaźni wodnej na kolejne 10 minut z przerywanym wirowaniem. Ponownie dokładnie wyczyść probówkę 70% etanolem i przynieś ją z powrotem do tkanki. Kaptur kulturowy.

Pipetuj tkankę korową w górę iw dół. Tak jak poprzednio tym razem za pomocą pięciomililitrowej pipety dodać 15 mililitrów ciepłego gleju, pożywki i wirować z prędkością 1000 obr./min przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 20 mililitrach świeżej pożywki glejowej.

Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki. Następnie połóż od pięciu do 7,5 miliona komórek w 15 mililitrach podłoża glejowego na kolbę o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Po jednym dniu umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i co dwa do trzech kolejnych dni w hodowli, usunąć luźne komórki, uderzając kolbą o powierzchnię kaptura.

Usuń pożywkę wraz z usuniętymi komórkami i zastąp ją 15 mililitrami świeżego gleju. Średni glej można zbierać po jednym do dwóch tygodni wzrostu w kolbach, gdy są one bliskie 100% zlewania się. Aby przygotować pojedyncze szkiełka nakrywkowe pokryte glejem, zacznij od umieszczenia sześciu oczyszczonych i wysterylizowanych kwasów azotowych.

25 milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe w 10-centymetrowym naczyniu i za pomocą małego pędzla umieść trzy kropki z mieszanki wazeliny parafinowej trzy do jednego. Na każdym szkiełku nakrywkowym w trójkątny wzór. Umieść dwie kropki na krawędziach szkiełka nakrywkowego, aby zakotwiczyć się w naczyniu.

Otwarte naczynia należy traktować światłem UV przez 30 minut. Pokryj szkiełka nakrywkowe poli D lizyną na godzinę. Następnie dokładnie umyj trzy do pięciu razy sterylną wodą dejonizowaną z filtrem i pozostaw do wyschnięcia, usuwając komórki glejowe z inkubatora.

Wyrzuć podłoże i umyj pięcioma mililitrami wstępnie ciepłej trypsyny. Dodać trzy mililitry trypsyny do kolby i inkubować przez minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odłączeniu komórek dodaj pięć mililitrów pożywki glejowej, aby zatrzymać trippin.

Wyjąć GL z kolby, pipetując w górę i w dół 10 do 15 razy. Następnie przenieś pożywkę do 15-mililitrowej wirówki stożkowej z prędkością 1000 obr./min na osiem minut. Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki glejowej.

Następnie, po policzeniu komórek, umieść je pięć razy po 10 do piątej komórki w 12,5 mililitra pożywki glejowej na 10-centymetrową płytkę zawierającą szkiełka nakrywkowe. Wymieniaj pożywkę na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę glejową co dwa do trzech dni na dzień przed sekcją neuronów. Usuń pożywkę glejową i zastąp ją pożywką wolną od surowicy.

Użyj tego wolnego podłoża z surowicy glejowej później. Podczas zalewania, kultur korowych lub hipokampa C dodaje się do końcowego stężenia pięciu mikromolowców. Aby zapobiec namnażaniu się glejów odczynników do afekcji nukleo podczas transfekcji, jak wskazano w instrukcjach producenta, należy ogrzać roztwór do temperatury pokojowej.

Umieścić naczynie zawierające E 15,5 mózgi myszy w zimnym podłożu preparacyjnym. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj wygiętej igły wolframowej, aby usunąć obie korowe neo. Następnie za pomocą mikrokleszczy usuń opony mózgowe i umieść korę w nowym naczyniu z zimnym podłożem preparacyjnym

Hipokamp i kora są widoczne wzdłuż przyśrodkowej strony półkuli mózgowej za pomocą małych nożyczek do tęczówki. Ostrożnie usuń hipokamp. Następnie usuń pozostałą korę.

Powtórz sekcję mózgów z całego miotu. Umieść hipopotama Camp Cortices w oddzielnych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra wypełnionych jednym mililitrem zimnego rozwarstwienia. Średni. Umieść rurki na lodzie Po wycięciu wszystkich kory mózgowej hipopotama Campi.

Dodaj 110 mikrolitrów 2,5% trypsyny do mikroprobówek zawierających tkankę i umieść probówki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Za pomocą pipety P 1000 usuń jak najwięcej płynu z probówki. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki galwanicznej do każdej probówki i umyj chusteczkę, delikatnie odwracając rurkę z mikro fuge.

Powtórz pranie dwa razy Po ostatnim umyciu dodaj jeden mililitr medium galwanicznego. Użyj pipety P 1000, aby trzykrotnie ocenić kawałki 15 razy. Następnie przenieś supernatant i komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej cztery mililitry pożywki galwanicznej, pozostawiając wszelkie kawałki, które pozostały w probówce z mikro fuge.

Wirować 15-mililitrową probówkę z prędkością 350 obr./min przez siedem minut z odrywaniem po odwirowaniu, wyrzucić supernatant i dodać 100 mikrolitrów wstępnie zmieszanej temperatury pokojowej. Roztwór do nawożenia jądra dla każdej pipety transfekcyjnej w górę i w dół pięć razy, aby wymieszać następny transfer. 100 mikrolitrów roztworu uczucia jądrowego i mieszaniny komórek do każdej nowej probówki mikro fuge zawierającej odpowiednią ilość DNA, jeden do dwóch mikrogramów DNA na transfekcję w przypadku hodowli długoterminowych oznaczy mniej niż 10% neuronów w kulturze.

Podczas gdy pięć do 10 mikrogramów DNA na transfekcję spowoduje wyższą wydajność transfekcji dla hodowli, dodaj zawiesinę komórkową i mieszankę DNA do elektroporacji. Następnie umieść vete w elektro. W przypadku mysich neuronów OUN ustaw program efektora nukleograficznego na oh 0 0 5 działający szybko, dodaj 500 mikrolitrów przedwojennego i zrównoważonego podłoża galwanicznego do qve i przenieś roztwór komórkowy do nowej 1,5 mililitrowej mikrorurki fuge.

Dodaj tyle podłoża galwanicznego, aby zwiększyć objętość każdej transfekcji do jednego mililitra. Po policzeniu komórek płytki od trzech do pięciu razy 10 do trzeciej komórki centymetr kwadratowy dla młodych kultur lub pięć do 10 razy 10 do trzeciej komórki, procent metra kwadratu dla hodowli długoterminowych, zwykle pięć razy 10 do piątej lub jedna razy 10 do szóstej. Komórki są używane podczas transfekcji do przygotowania krótkoterminowych kultur.

Godzinę po posiewie zalej 35-milimetrowe szalki hodowlane dwoma mililitrami ciepłego dwutlenku węgla w równowadze, zalewając pożywkę wolną od surowicy. Komory obrazowania skutkują bardzo niską zawartością surowicy poniżej 0,5%Hodowle krótkoterminowe nie muszą być hodowane za pomocą warstwy zasilającej glej i nie muszą być trzciną. Aby przygotować długoterminowe posiewy, dodaj jeden mililitr stanu glejowego do pożywki wolnej od surowicy.

Usuń zakryte szkiełko nakrywkowe GL zawierające trzy kropki wazeliny parafinowej i odwróć je nad 15-milimetrowym otworem w naczyniu 35. Następnie dodaj kolejny mililitr pożywki, aby nakarmić długoterminowe kultury. Wymieniaj jedną trzecią wolnego podłoża surowicy co dwa do trzech dni.

Po pięciu do siedmiu dniach w hodowli cytozynę arabską IDE lub aee dodaje się do końcowego stężenia pięciu mikromolów, aby zapobiec proliferacji gleju. Poniższe sparowane obrazy reprezentatywnych żyjących neuronów hipokampa pokazują zarówno obraz kontrastu interferencyjnego różnicowego, jak i odpowiadający mu mikrograf fluorescencyjny. Każda z tych komórek została transfekowana EGFP, tubuliną i czerwonym DS dwoma w wektorach PA.

W pierwszym etapie neurony początkowo przyczepiają się i w ciągu około jednego dnia wystają jak prześcieradło la melo podia i przypominające palec Filip podia wokół obwodu ciała komórki. Podczas drugiego etapu początkowe wypukłości różnicują się w kilka neurytów emanujących z ciała komórki, zwykle pozostających o długości około 30 do 50 mikronów. Podczas trzeciego etapu stochastycznie jeden z neurytów zaczyna się gwałtownie rozszerzać, stając się aksonem.

Pozostałe neuryty pozostają krótkie i nazywane są drobnymi procesami. Większość neuronów hipokampa i kory mózgowej przeszła do etapu trzeciego przez dwa do trzech dni w hodowli podczas etapu czwartego, który występuje w ciągu następnego tygodnia lub dwóch drobnych procesów, gęstnieje, wydłuża się i rozgałęzia, aby stać się dendrytami, które są pokazane na zielono. Tymczasem akson przerzedza się, gdy nadal rośnie i rozgałęzia się przez dwa do trzech tygodni.

W kulturze dendryty różnicują się, tworząc kolce dendrytyczne, małe wypukłości wzdłuż dendrytów. Neurony w stadium piątym będą się różnić kształtem i rozmiarem, ale większość z nich powinna przejść tę serię etapów rozwojowych. Transfekowane neurony mogą nie przejść przez te etapy, jeśli nadekspresja białek zakłóca rozwój neuronów.

Ponadto neurony mogą nie przechodzić przez wszystkie etapy rozwoju. Jeśli szkiełka nakrywkowe nie są odpowiednio oczyszczone lub polilizyna nie przylega prawidłowo, glej może również intensywnie się namnażać, zwłaszcza jeśli nie stosuje się C. Jest to obraz kontrastu fazowego dwutygodniowej kultury, w której glej przerósł kulturę w kulturach długoterminowych.

Zbyt częsta lub niewystarczająca zmiana podłoża może również zagrozić żywotności neuronów. Jest to obraz z kontrastem fazowym kultury, w której większość neuronów obumarła, a pozostałe neurony mają skurczone ciała komórkowe i wyrostki koralikowe Dla porównania, jest to obraz z kontrastem fazowym zdrowych neuronów hipokampa po dwóch tygodniach hodowli. Zwróć uwagę na większe korpusy komórek i brak bicia w procesach.

Również na tym etapie procesy dendrytyczne uległy pogrubieniu i występuje rozległy filigran wyrostków aksonalnych. Po opanowaniu, rozbiory embrionalne, korowe i rozwarstwienie, transfekcja i posiew całego miotu płodów mogą być wykonane w ciągu dwóch godzin, jeśli są wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że neurony hipokampa i kory mózgowej są bardzo wrażliwe na zakłócenia mechaniczne.

Ważne jest również, aby podczas izolacji neuronów roztwory były jak najzimniejsze, aby utrzymać niską aktywność metaboliczną. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek i fizjologiczne rejestrowanie aktywności, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób fluorescencyjne białka fuzyjne dzielą się na różne regiony neuronu. Czy lokalizacja białek jest związana ze zmianami w aktywności synaptycznej lub jak na funkcje tych białek wpływają różne metody leczenia farmakologicznego.