Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Neurony hipokampa i kory mózgu są szeroko wykorzystywane do badania polaryzacji neuronów ośrodkowego układu nerwowego, wzrostu aksonów i dendrytów oraz powstawania i funkcji synaps; zaletą hodowli tych neuronów jest to, że łatwo ulegają one polaryzacji, tworząc charakterystyczne aksony i dendryty na podłożu dwuwymiarowym przy bardzo niskich gęstościach. Niniejszy materiał wideo prezentuje technikę wyizolowania, hodowli i transfekcji embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy za pomocą nukleofekcji, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych znakowanych fluorescencyjnie we wczesnej fazie rozwoju, około od czterech do ośmiu godzin po wysianiu. Ekspresja białek znakowanych fluorescencyjnie jest utrzymywana przez cały okres życia neuronu, przez ponad dwa miesiące hodowli. Pozwala to na badanie funkcji białek podczas wczesnych zdarzeń rozwojowych, takich jak wzrost aksonów, oraz późniejszych etapów, takich jak synaptogeneza i plastyczność synaptyczna.

W pierwszej kolejności komórki glejowe izoluje się z półkul korowych myszy w pierwszym do trzeciego dniu po urodzeniu, a następnie wysiewa do kolb. Po osiągnięciu konfluencji na poziomie od 70 do 100%, komórki glejowe są przesiewane na szklane kryszalki.

Następnie z myszy w stadium E 15.5 izoluje się neurony hipokampa lub kory mózgowej i poddaje je transfekcji metodą nucleofekcji plazmidami kodującymi fluorescencyjne białka fuzyjne, takie jak czerwone białko fluorescencyjne. Transfekowane neurony wysiewa się następnie do komór obrazujących w celu przeprowadzenia badań krótkoterminowych. W przypadku kultur długoterminowych, komórki glejowe na szkiełkach podstawkowych odwraca się nad kulturami hipokampa lub kory w celu zapewnienia wsparcia troficznego; następnie można obrazować poszczególne neurony, aby ukazać dynamiczną lokalizację białek fuzyjnych w aksonach lub dendrytach neuronów.

Witam, jestem Eric Dent, profesor pomocniczy anatomii na University of Wisconsin Madison. Dzisiaj troje moich studentów studiów licencjackich, Chris Wezelman, Jason Bwe i Derek Lombard, zademonstruje procedurę izolacji, wysiewania i utrzymywania kultur neuronów korowych i hipokampalnych w krótkoterminowych i długoterminowych kulturach. Kultury te mogą być wykorzystywane do badania dynamiki fluorescencyjnych białek fuzyjnych w trakcie rozwoju neuronalnego, od początkowego wzrostu neurytów, poprzez rozwój aksonów i dendrytów, aż po synaptogenezę.

Aby przygotować komory do obrazowania, należy użyć embrionalnych neuronów hipokampa i kory mysiej. Należy rozpocząć od 35 milimetrowych szalek Petriego z wywierconymi w dnie otworami o średnicy 15 milimetrów, po usunięciu wszystkich wiórów. Roztopić mieszaninę parafiny i wazeliny w stosunku trzy do jednego w probówce stożkowej, umieszczając ją w łaźni wodnej z wrzącą wodą.

Następnie za pomocą małego pędzla pokryć spód szalki wokół otworu. Należy pamiętać o wymieszaniu parafiny z wazeliną pomiędzy aplikacjami do kolejnych komór, ponieważ składniki te mają tendencję do rozwarstwiania się. Na otwór nałożyć szkiełko nakrywki.

Po przygotowaniu wszystkich szalek należy umieścić je w piekarniku nagrzanym do 80 °C, aż mieszanina parafiny się rozpuści. Powinno to zająć około 10 minut. Następnie należy wyjąć szalki, położyć je na płaskiej powierzchni i pozostawić mieszaninę parafiny do zastygnięcia na co najmniej jedną minutę.

Odwróć szalki i umieść je pod wyciągiem. Włącz lampę UV na 30 minut, aby wysterylizować zarówno wewnętrzne strony pokrywek, jak i dna komór. Następnie przejdź do powlekania.

Okładki komory pokrywa się poli-D-lizyną na jedną godzinę. Następnie pokrywki z powłoką należy dokładnie wypłukać od trzech do pięciu razy sterylną odfiltrowaną wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie ślady buforu borowego. Po ostatnim płukaniu komory należy osuszyć za pomocą pompy próżniowej. Mogą one zostać użyte natychmiast lub przechowywane w pomieszczeniu do hodowli tkankowej do późniejszego użycia.

Powlekane komory powinny zostać użyte w ciągu jednego tygodnia od przygotowania, jeśli planowane są hodowle długoterminowe. Warstwy pokarmowe gleju korowego należy przygotować od dwóch do trzech tygodni przed przystąpieniem do wycinania fragmentów kory lub hipokampa. Mózgi czterech myszy z miotu P1 do P3 należy umieścić w naczyniu zawierającym zimne medium do mikrodysekcji i ustawić pod mikroskopem dissectingowym.

Usuń opłaty węchowe, obie półkule mózgu oraz opony mózgowe. Przenieś półkule do nowej szalki niezawierającej pożywki. Używając czystego, sterylnego ostrza brzytwy, rozdrobnij korę mózgową tak drobno, jak to możliwe.

Następnie za pomocą plastikowej pipety przenieś posiekaną tkankę do 50 mililitrowej probówki stożkowej zawierającej 12 mililitrów zimnego Medium do sekcji. Dodaj trypsynę i DNase do końcowych stężeń odpowiednio 0,25% i 0,1%. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, okresowo delikatnie mieszając zawiesinę.

Po inkubacji wyjmij probówkę z kąpieli wodnej i dokładnie oczyść ją 70% etanolem przed przeniesieniem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Pipetuj tkankę kory w górę i w dół.

Za pomocą pipety 10 ml odessaj zawartość około 10 do 15 razy lub do momentu zniknięcia większości grudek, a następnie przenieś probówkę z powrotem do kąpieli wodnej na kolejne 10 minut, okresowo delikatnie nią potrząsając. Ponownie dokładnie oczyść probówkę 70% etanolem i przenieś ją z powrotem pod dygestorium do hodowli tkanek.

Pipetuj tkankę kory góra-dół. Podobnie jak poprzednio, tym razem używając pipety pięciomililitrowej, dodaj 15 ml ciepłego medium glialnego i wiruj przy 1000 RPM przez 10 minut. Odlej supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 20 ml świeżego medium glialnego.

Użyj komory countingowej (hemo-cytometru) do policzenia komórek. Następnie wysiej od 5 do 7,5 miliona komórek w 15 mililitrach pożywki glejowej na kolbę o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza; po jednym dniu oraz co dwa do trzech kolejnych dni hodowli usuwaj luźne komórki, uderzając kolbą o powierzchnię dygestorium.

Usuń pożywkę wraz z wszelkimi oderwanymi komórkami i zastąp ją 15 mililitrami świeżego pożywki dla gleju. Glej można zebrać po jednym do dwóch tygodniach wzrostu w kolbach, gdy osiągną one około 100% konfluencji. Aby przygotować pojedyncze szkiełka podstawowe pokryte glejem, zacznij od umieszczenia sześciu oczyszczonych kwasem azotowym i wysterylizowanych.

Umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm w szalce 10 cm i za pomocą małego pędzla nanieść trzy kropki mieszaniny wazeliny parafinowej w proporcji 3:1 na każde szkiełko, tworząc wzór trójkąta. Na krawędziach szkiełka nakrywkowego nanieść dwie kropki, aby przymocować je do szalki.

Naświetlaj otwarte szalki promieniami UV przez 30 minut. Pokryj szkiełka nakrywkowe poli-D-lizyną i pozostaw na jedną godzinę. Następnie płucz dokładnie od trzech do pięciu razy sterylną, filtrowaną wodą dejonizowaną, pozostaw do wyschnięcia i wyjmij komórki glejowe z inkubatora.

Odessać medium i przemyć pięcioma mililitrami podgrzanej wcześniej trypsyny. Dodać trzy mililitry trypsyny do kolby i inkubować przez jedną minutę w temperaturze 37 °C. Po odklejeniu się komórek dodać pięć mililitrów medium glejowego, aby zatrzymać działanie trypsyny.

Usuń GL z kolby, pipetując ciecz w górę i w dół od 10 do 15 razy. Następnie przenieś medium do 15-mililitrowej probówki stożkowej i wiruj przy 1000 RPM przez osiem minut. Po odwirowaniu osadu zawieś komórki w 10 mililitrach medium dla gleju.

Następnie, po policzeniu komórek, wysiej 5 × 10⁵ komórek w 12,5 ml pożywki glialnej na płytkę 10 cm zawierającą szkiełka podstawowe. Wymieniaj pożywkę na świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę glialną co dwa do trzech dni, aż do dnia poprzedzającego wyizolowanie neuronów. Usuń pożywkę glialną i zastąp ją pożywką bezsurowiczą.

Użyj tego medium bezsurowiczego do kondycjonowania glejowego w późniejszym etapie. Podczas zalewania kultur korowych lub hipokampalnych dodaje się C do stężenia końcowego 5 µM. Aby zapobiec proliferacji gleju, użyj odczynników do transfekcji nukleowej zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie ogrzej roztwór do temperatury pokojowej.

Umieść naczynie zawierające mózgi myszy w stadium E 15.5 w zimnym medium do mikrodysekcji. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą zgiętej igły wolframowej, usuń obie korory nowej. Następnie, używając mikropincety, usuń opony mózgowe i przenieś korę do nowego naczynia z zimnym medium do mikrodysekcji.

Hipokamp i kora są widoczne wzdłuż strony przyśrodkowej półkuli mózgu; użyj małych nożyczek irydologicznych. Ostrożnie usuń hipokamp. Następnie usuń pozostałą część kory.

Powtórz sekcję mózgów wszystkich osobników z miotu. Umieść korę hipokampa w oddzielnych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra wypełnionych jednym mililitrem zimnego medium sekcyjnego. Umieść probówki na lodzie po wycięciu wszystkich obszarów kory i hipokampów.

Dodaj 110 µL 2,5% trypsyny do probówek typu microfuge zawierających tkankę i umieść probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 minut. Za pomocą pipety P 1000 usuń z probówki jak najwięcej płynu. Następnie dodaj 1 mL medium hodowlanego do każdej probówki i przemyj tkankę, delikatnie odwracając probówkę.

Powtórz płukanie dwukrotnie. Po ostatnim płukaniu dodaj 1 ml medium do wysiewu. Za pomocą pipety P 1000 potryturuj fragmenty tkanki 15 razy. Następnie przenieś nadsącz wraz z komórkami do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml medium do wysiewu, pozostawiając wszelkie pozostałe fragmenty tkanki w probówce do wirówki.

Wiruj probówkę o pojemności 15 ml przy 350 RPM przez siedem minut z wyłączonym hamulcem po zakończeniu wirowania, odlej nadsącz i dodaj 100 µl uprzednio przygotowanego w temperaturze pokojowej roztworu do nuklefekcji dla każdej transfekcji; pipetuj w górę i w dół pięć razy w celu wymieszania, następnie przenieś 100 µl mieszaniny roztworu do nuklefekcji i komórek do każdej nowej probówki do wirówki zawierającej odpowiednią ilość DNA; 1 do 2 µg DNA na transfekcję dla kultur długoterminowych oznakuje mniej niż 10% neuronów w kulturze.

Podczas gdy zastosowanie od 5 do 10 µg DNA na jedną transfekcję zapewni wyższą wydajność transfekcji w hodowli, należy dodać zawiesinę komórkową i mieszankę DNA do kuwety do elektroporacji. Następnie umieść kuwetę w elektroporatorze. W przypadku neuronów OUN myszy ustaw program nucleo effector na 0 0 5; działając szybko, dodaj 500 µL uprzednio ogrzanej i wyrównanej temperatury pożywki do wysiewu do kuwety, a następnie przenieś roztwór komórkowy do nowej probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml.

Dodać wystarczającą ilość pożywki do wysiewu, aby objętość każdej transfekcji wyniosła 1 mL. Po policzeniu komórek, wysiać od 3 do 5 × 10³ komórek/cm² w przypadku kultur krótkoterminowych lub od 5 do 10 × 10³ komórek/cm² dla kultur długoterminowych; zazwyczaj do przygotowania kultur krótkoterminowych stosuje się od 5 × 10⁵ do 1 × 10⁶ komórek na transfekcję.

Godzinę po wysianiu wypełnij 35 milimetrowe płytki hodowlane dwiema mililitrami ciepłego, nasyconego dwutlenkiem węgla medium bezsurowiczego. Komory obrazowania zapewniają bardzo niską zawartość surowicy, poniżej 0,5%. Hodowle krótkoterminowe nie wymagają hodowania z warstwą pokarmową gleju ani ponownego wysiewania. Aby przygotować hodowle długoterminowe, dodaj jeden mililitr kondycjonatu glialnego do medium bezsurowiczego.

Zdejmij szkiełko nakrywkowe GL zawierające trzy kropelki wazeliny petyrolatycznej i odwróć je nad otworem o średnicy 15 mm w szalce 35 mm. Następnie dodaj kolejny 1 ml pożywki, aby odżywić kultury długoterminowe. Wymieniaj jedną trzecią pożywki bez surowicy co dwa do trzech dni.

Po pięciu do siedmiu dniach hodowli dodaje się cytozynę arabinozyd (Ara-C) do stężenia końcowego 5 µM w celu zapobiegania proliferacji gleju. Poniższe zestawione obrazy reprezentatywnych żywych neuronów hipokampa przedstawiają zarówno obraz w kontraście interferencyjnym różnicowym, jak i odpowiadający mu mikrograf fluorescencyjny. Każda z tych komórek została przetransfekowana wektorami pA kodującymi EGFP, tubulinę oraz DsRed2.

W fazie pierwszej neurony początkowo przylegają do podłoża, a w ciągu około jednego dnia wytwarzają w obrębie obwodu ciała komórki płaskie lamellipodia oraz palczaste filopodia. W fazie drugiej pierwotne wypustki różnicują się w kilka neurytów wyrastających z ciała komórki, które zazwyczaj zachowują długość od 30 do 50 µm. W fazie trzeciej, w sposób stochastyczny, jeden z neurytów zaczyna gwałtownie wydłużać się, przekształcając się w akson.

Pozostałe neuryty pozostają krótkie i nazywane są wypustkami pobocznymi. Większość neuronów hipokampa i kory dotarła do etapu trzeciego w ciągu dwóch do trzech dni hodowli; podczas etapu czwartego, który trwa przez kolejny tydzień lub dwa, wypustki poboczne grubieją, wydłużają się i rozgałęziają, przekształcając się w dendryty, tutaj pokazane na zielono. W międzyczasie akson cieńczeje w miarę dalszego wzrostu i rozgałęziania się do drugiego lub trzeciego tygodnia.

W hodowli dendryty różnicują się poprzez tworzenie kolców dendrytycznych, czyli małych wypustek wzdłuż dendrytów. Neurony w piątym stadium będą różnić się kształtem i rozmiarem, jednak większość z nich powinna przejść przez tę serię etapów rozwojowych. Neurony przetransfekowane mogą nie przechodzić przez te stadia, jeśli nadekspresja białek zaburzy rozwój neuronalny.

Ponadto neurony mogą nie przejść przez wszystkie etapy rozwoju. Jeśli szkiełka zakrywa nie zostaną odpowiednio oczyszczone lub polilizyna nie przylgnie prawidłowo, może dojść również do intensywnej proliferacji gleju, zwłaszcza jeśli nie zostanie użyty C. Jest to obraz w kontraście fazowym dwutygodniowej hodowli, w której w hodowlach długoterminowych glej przerósł kulturę.

Zbyt częsta lub zbyt rzadka wymiana pożywki może również negatywnie wpłynąć na żywotność neuronów. Jest to obraz w kontraście fazowym hodowli, w której większość neuronów obumarła, a pozostałe neurony mają skurczone ciała komórkowe i paciorkowate wypustki. Dla porównania, tutaj znajduje się obraz w kontraście fazowych zdrowych neuronów hipokampa po dwóch tygodniach hodowli. Zwróć uwagę na większe ciała komórkowe oraz brak paciorkowania w wypustkach.

Ponadto na tym etapie wypustki dendrytyczne uległy pogrubieniu, a wypustki aksonalne tworzą rozległą siatkę. Po opanowaniu tej techniki, preparatyka embrionalna, korowa i sekcja, a także transfekcja i wysiew całego miotu płodów mogą zostać wykonane w ciągu dwóch godzin, jeśli procedura jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że neurony hipokampa i kory są bardzo wrażliwe na uszkodzenia mechaniczne.

Ważne jest również, aby podczas izolacji neuronów utrzymywać roztwory w jak najniższej temperaturze, aby zminimalizować aktywność metaboliczną. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek oraz fizjologiczne rejestrowanie aktywności, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób fluorescencyjne białka fuzyjne budzące zainteresowanie segregują się do różnych obszarów neuronu. Pozwala to również zbadać, czy lokalizacja białek jest powiązana ze zmianami w aktywności synaptycznej oraz w jaki sposób funkcje tych białek są modyfikowane przez różne zabiegi farmakologiczne.