Ex vivo Ekspansja limfocytów T reagujących na nowotwór za pomocą bryostatyny 1/jonomycyny i preparatu Common Gamma Chain Cytokin

Celem tego eksperymentu jest wywołanie aktywacji limfocytów T przez jeden jon mycyny statyny Brios, a także różnicowanie limfocytów T przez cytokiny łańcucha gamma, rozpoczynając się od izolacji uczulonych na nowotwór limfocytów T ze śledziony i węzłów chłonnych. Następnie aktywuj za pomocą brios statyny jeden i jon mycyny dwóch mimetyki sygnału wewnątrzkomórkowego, które zwiększają odpowiednio aktywność kinazy białkowej C i wewnątrzkomórkowego wapnia. Hodowla w obecności IL siedem IL 15 i IL dwa do różnicowania i ekspansji komórek T reagujących na nowotwór.

Potężne połączenie wyników interferonu gamma EISA i testu cytotoksyczności może rzucić światło na reaktywność guza ekspandowanych limfocytów T i zaoferować potencjalny wgląd w immunoterapię adoptywną. Ta metoda ekspansji exvivo limfocytów T reagujących na nowotwór może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w pytaniach immunologicznych nowotworów, takie jak rola powszechnych cytokin obrazowania gamma w różnicowaniu komórek T reagujących na nowotwór. I jaka jest rola każdego fenotypu limfocytów T, takich jak komórki efektorowe, komórki pamięci efektorowej i komórki pamięci centralnej w generowaniu odpowiedzi pamięci długotrwałej przeciwko rakowi.

Izolacja węzłów chłonnych i śledziony oraz septyczne obchodzenie się z limfocytami są procedurami trudnymi do wdrożenia, ale można się ich szybko nauczyć. Przez obserwację. Transgeniczne samice myszy FVBN 2 0 2 wykazywały ekspresję inaktywowanego nowego transgenu szczura pod regulacją promotora MMTV, w wyniku czego rozwinął się spontaniczny rak sutka między czwartym a 10 miesiącem życia.

W tym protokole te spontaniczne myszy z nowotworem są wykorzystywane jako dawcy komórek T reagujących na nowotwór. Aby rozpocząć izolowanie węzłów chłonnych i śledziony drenującej guz od myszy transgenicznych zawierających FVBN 2 0 2. Teraz przygotuj zawiesinę jednokomórkową w lodowatym RPMI 1640 uzupełnioną 10% FB sce Hodowla w ilości od 10 do sześciu komórek na mililitr w kompletnym pożywce zawierającej 15% FBS z jedną mikromolową cyną pięć nano molowych statyn brios jeden i 80 jednostek na mililitr.

IL dwa przez 16 godzin z naszą pożywką PMI w równowadze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, umyj komórki trzy razy, a następnie hoduj w temperaturze od 10 do sześciu komórek na mililitr w kompletnym podłożu z 10 nanogramami na mililitr, każda z IL siedem i IL 15 przez 24 godziny. W celu dalszej aktywacji komórek wykonuj impuls z dodatkiem 40 jednostek na mililitr IL dwie przez 24 godziny. Teraz podziel komórki i hoduj je z 10 nanogramami na mililitr, każdy z IL siedem i IL 15 przez kolejne cztery dni, jeśli to konieczne, zmień pożywkę i dziel komórki co dwa dni.

Zbierz rozszerzone pierwotne limfocyty T przez odwirowanie, policz komórki za pomocą mikroskopii świetlnej i oblicz krotne zwiększenie limfocytów T. Teraz przygotuj komórki do cytometrii przepływowej, aby określić proporcję limfocytów T CD ośmiu dodatnich i CD czterech dodatnich. Najpierw blokuj niespecyficzne wiązanie przeciwciał z receptorami FC poprzez inkubację komórek z przeciwciałem anty CD 16, CD 32 przez 20 minut na lodzie.

Następnie umyj komórki dwukrotnie dwoma mililitrami lodowatego PBS uzupełnionego 1% azydkiem sodu, wybarwić komórki przez inkubację z przeciwciałami Fitz CD cztery i PE CD osiem przez 20 minut na lodzie. Przemyć dwukrotnie dwoma mililitrami lodowatego PBS uzupełnionego 1% FBS i 0,1% azydku sodu. Na koniec utrwal komórki za pomocą 1% aldehydu paraform i przeanalizuj próbki na Beckman Coulter FC 500 za pomocą oprogramowania Summit w wersji 4.3 w sześciodołkowych płytkach hodowlanych, pipetuj limfocyty T komórkami guza sutka w stosunku 10 do jednego efektora do celu i trzy mililitry na dołek.

Kompletna pożywka zawierająca 20 jednostek na mililitr IL dwie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Wykonaj barwienie przeciwciał w trzech kolorach dla nowych, a następnie PE anty-US IgG i Xin five fite i jodku propidyny zgodnie z faktami bramki protokołu producenta na nowych dodatnich komórkach nowotworowych i przeanalizuj żywotność komórek nowotworowych za pomocą Xin pięć pi. Aktywacja limfocytów T za pomocą BI przez 16 godzin powoduje zabicie naiwnych limfocytów T, które nie są uwrażliwione na guz in vivo.

Po biselektywności limfocytów T reagujących na nowotwór, rozszerzają się one do 2,8 razy w ciągu sześciodniowej hodowli z cytokinami łańcucha gamma, zarówno limfocyty T CD 8-dodatnie, jak i CD 4-dodatnie są równomiernie rozszerzone cytokinami łańcucha gamma. Po sześciodniowej hodowli ex vivo, ekspandowane limfocyty T ex vivo wykazują wysoką reakcję na nowotwory, na które myszy dawcy były uwrażliwione, co oceniano na podstawie produkcji interferonu gamma. W obecności nowego dodatniego raka sutka myszy lub komórek nowotworowych MMC, ekspandowane limfocyty T ex vivo mogą indukować apoptozę w nowych dodatnich komórkach nowotworowych MMC, tak że żywotność komórek nowotworowych spada z 92% do 61% w ciągu 48 godzin.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o pracy w warunkach aseptycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybierać i rozszerzać aktywne komórki T guza do adaptacyjnej terapii komórek T nowotworów.