Name: Zatopione w parafinie i zamrożone odcinki dorosłych mięśni Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj technikę histologiczną przygotowywania zatopionych w parafinie i zamrożonych preparatów mięśni tułowia Drosophila. Metoda umożliwia analizę morfologii mięśni i lokalizacji białek w badaniach biologii mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy prof. Eichele za umożliwienie skorzystania z kriomikrotomu. Praca została sfinansowana przez Max-Planck-Gesselschaft.

1. Przygotowanie
<ol>
<li>Świeżo przygotuj utrwalacz Carnoya, łącząc absolutny etanol, chloroform i lodowaty kwas octowy w proporcjach odpowiednio 6:3:1.3 Ten preparat, jak i wszystkie roztwory do zanurzania kołnierzy, należy przechowywać w szklanych słoikach do barwienia (zalecenia znajdują się w sekcji odczynników).</li>
<li>Przygotuj kieszonki z folii aluminiowej o rozmiarze dopasowanym do kołnierzy.</li>
<li>Przygotuj w słoikach do barwienia następujące roztwory: 2 X 40% etanol, 70% etanol, 2 X 100% etanol, benzoesan metylu (MB), mieszaninę MB i parafiny 50/50 v/v oraz 2 X parafina. Pojemniki z MB i parafiną umieść w inkubatorze ustawionym na 60-65°C.</li>
<li>Podgrzej parafinę do 60-65°C, aby można było ją wlać do kieszonek z folii.</li>
</ol>
2. Unieruchamianie much w kołnierzach
<ol>
<li>Przymocuj kołnierz 4 pod stereomikroskopem za pomocą taśmy, w pozycji pionowej, tak aby widoczny był punkt wejścia dla muchy.</li>
<li>Zanurz muchy w narkozie, używając dwutlenku węgla lub poprzez hipotermię z wykorzystaniem bloku lodu. Należy uważać, aby nie zamrozić much.</li>
<li>Za pomocą pęsety chwyć poszczególne muchy za skrzydła i umieść je w kołnierzu w odpowiedniej orientacji (głowa i tułów nad ostrzami, a odwłok pod ostrzami). W kołnierzu powinno bez problemu zmieścić się 10-20 much.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli analizujesz kilka genotypów, nie zapomnij zanotować numeru kołnierzyka oraz odpowiadającego mu genotypu.
3. Przekroje parafiniowe klatki piersiowej Drosophila
<ol>
<li>Przenieś obrączkę do roztworu Carnoya i utrwal tkankę w temperaturze 4°C przez noc.</li>
<li>Po utrwaleniu odwodnij próbkę, korzystając z rosnących stężeń etanolu. Przez 10 minut zanurzaj obrączkę w 40% (2 razy), 70% i 100% (2 razy) etanolu w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj obrączkę w MB oraz w roztworze MB + parafina (1:1) po 30 min w każdym z nich, a następnie przeprowadź infiltrację obrączki w dwóch zmianach parafiny po 60 min każda w temperaturze 60-65°C. Szybko przenieś obrączkę do kieszonki z folii i wypełnij stopioną (60-65°C) parafiną. Pozostaw w temperaturze pokojowej do stwardnienia parafiny (najlepiej na noc). Należy pamiętać, że obrączkę można umieścić w kieszonce z folii w różnych orientacjach, w zależności od wymaganej orientacji przekrojów (podłużnych lub poprzecznych).</li>
<li>Rozwiń suche bloki parafinowe z obrączkami z folii i delikatnie oddziel obrączkę od bloku parafinowego. Za pomocą ostrego ostrza lub skalpela ostrożnie usuń nadmiar parafiny z wokół tkanki muchy.</li>
<li>Wykonaj skrawki z bloku parafinowego o grubości 7-10 μm na mikrotomie obrotowym i pozwól wyciętym tkankom swobodnie pływać w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Umieść przekroje tkankowe na szkiełkach polaryzacyjnych i pozostaw do wyschnięcia na noc. Szkiełka te można wykorzystać do barwienia hematoksyliną i eozyną (Rycina 1A-D), błękitem toluidyny, błękitem anilinowym lub innymi barwnikami w celu wizualizacji struktur tkankowych, a także do barwienia przeciwciałami (Rycina 1E-E``).</li>
</ol>
4. Kriostatyczne przekroje klatki piersiowej Drosophila
<ol>
<li>Podobnie jak w przypadku przekrojów parafiniowych, przygotuj muchy w kołnierzu i uformuj kieszonkę z folii aluminiowej. Do przygotowania próbek niezbędna będzie chłodnica mrożąca. Upewnij się, że temperatura w chłodnicy wynosi około -60°C; użyj niewielkiej ilości etanolu i suchego lodu, aby osiągnąć tę wartość. Na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu umieść butelkę z medium do kriozatopienia (Tissue-Tek O.C.T. compound) dnem do góry w lodówce o temperaturze 4°C, aby ją schłodzić i zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Przenieś kołnierz z muchami do kieszonki z folii, która była schładzana przez kilka minut w chłodnicy mrożącej, i szybko wypełnij ją związkiem do kriozatopienia. Pozostaw próbkę do zamrożenia na 3-10 min. Ostrożnie rozwiń powstały blok wewnątrz chłodnicy, delikatnie oddziel kołnierz od bloku zatopienia i przechowuj go w temperaturze -20°C przez co najmniej jeden dzień.</li>
<li>Wykonaj skrawki zamrożonych mięśni na kriomikrotomie w temperaturze od -15 do -18°C, przy grubości przekroju 10-15 μm. Umieść je na szkiełkach polaryzacyjnych i przechowuj w temperaturze -20°C do momentu dalszej obróbki. Sugerujemy utrwalenie tkanki w 4 % roztworze formaldehydu w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej przed barwieniem przeciwciałami.</li>
</ol>
5. Wykrywanie lipidów w mięśniach Drosophila
Kropelki lipidowe można wykryć za pomocą barwienia Oil Red O na kryosekcjach, stosując protokół opracowany przez Siebera i Thummela 5.
<ol>
<li>Po utrwaleniu przemyć preparaty wodą dwukrotnie przez 5 min, inkubować w glikolu propylenowym przez 10 min w celu równoważenia, a następnie inkubować przez 3 h w barwniku Oil Red O w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć próbki 2 razy przez 5 min w glikolu propylenowym oraz przez 30 min w PBS. Zamontować w 30 % glicerolu.</li>
</ol>

6. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="Histologia, obrazy mikroskopowe struktur mięśniowych i komórkowych, przedstawione techniki barwienia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przekroje zatopione w parafinie 
Przekroje poprzeczne (A-B) i podłużne (C-D) mięśni pośrednich lotu barwionych hematoksyliną i eozyną. Na zdjęciach A i C widoczne są mięśnie o prawidłowej strukturze. Mięśnie o nieprawidłowej wielkości i morfologii przedstawiono odpowiednio na zdjęciach B i D (czarne strzałki). Przekrój poprzeczny Muszka owocówka thorax barwiony przeciwciałami anty-LamC, markerem otoczki jądrowej oraz DAPI, barwnikiem jąder komórkowych (E-F). Powiększony widok mięśni prawidłowych (czerwona strzałka) i zdegradowanych (żółta strzałka) (F). G przedstawia przekrój przez Muszka owocówka przewód pokarmowy barwiony LamC i DAPI.
<img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe tkanki: komórki znakowane Oil Red O (kolor niebieski), DAPI (kolor zielony) oraz Dg (kolor czerwony)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Przekroje mrożone 
A. Poprzeczne mrożone sekcje Muszka owocówka klatka piersiowa barwiona Oil Red O, obrazowanie kropel lipidowych. 
B.	Przekroje podłużne mrożone mięśni pośrednich lotu barwione przeciwciałami anty-Dg, markerem sarkolemy mięśniowej oraz DAPI.

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).</li>
<li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li>
<li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li>
<li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnoy+fixation%3A+practical+and+theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemie%22%5BJournal%5D)">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila+-+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila - A Laboratory Manual</a>. , CSHL Press. (1989).</li>
<li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

<table><tbody><tr><td>Kołnierze ze stali nierdzewnej</td><td>Własny wyrób</td><td></td><td>Specjalna konstrukcja</td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze lub skalpel</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makroskopowy słoik do barwienia Wheaton</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Model: Hyrax M25</td></tr><tr><td>Kriomikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Model CM3050S</td></tr><tr><td>Inkubator 60-65&amp;#x00B0;C</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Wystarczająco duży, aby pomieścić co najmniej 4 słoiki do barwienia</td></tr><tr><td>Chłodnica do mrożenia z blokiem metalowym</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Przechowywać w -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Szkiełka Super-frost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>9161155</td><td></td></tr><tr><td>Kapturki</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Zalecane 24 X 40 mm</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>Stopień czystości analitycznej</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100063</td><td>Stopień czystości analitycznej</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100983</td><td>Stopień czystości analitycznej</td></tr><tr><td>Metylobenzoesanian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M29908-500G</td><td>Stopień czystości analitycznej</td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76258</td><td>Parafina</td></tr><tr><td>Związek Tissue-Teck O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyd, bezmetanolowy</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników drosophila

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Molekularna charakterystyka dystrofii mięśniowych i miopatii u ludzi ujawniła złożoność chorób mięśni, a analizy genetyczne specyfikacji, formowania i funkcji mięśni w systemach modelowych dostarczyły cennych informacji na temat fizjologii mięśni. Dlatego identyfikacja i charakterystyka mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uszkodzeń mięśni mają kluczowe znaczenie. Budowa wielkowłóknistych mięśni dorosłych osobników Drosophila przypomina prążkowane mięśnie kręgowców 1, a podatność genetyczna Drosophila sprawiła, że jest to doskonały system do analizy morfologii mięśni dystroficznych i charakterystyki procesów wpływających na funkcję mięśni u starzejących się dorosłych much 2. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków wlewanych w parafinę oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Preparaty te pozwalają na barwienie tkanek klasycznymi barwnikami histologicznymi oraz znakowanie barwnikami wykrywającymi białka; w szczególności skrawki mrożone są idealne do detekcji immunohistochemicznej białek w nienaruszonych mięśniach. Umożliwia to analizę struktury tkanki mięśniowej, identyfikację wad morfologicznych oraz wykrywanie wzorców ekspresji białek specyficznych dla mięśni i neuronów w mięśniach dorosłych osobników Drosophila. Techniki te mogą być również lekko zmodyfikowane w celu wykonania skrawków z innych części ciała.

Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń mięśni jest kluczowa. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków z laniny oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Pozwala to na analizę morfologii mięśni oraz lokalizację białek i innych składników komórek mięśniowych.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

Charakterystyka molekularna dystrofii mięśniowych i miopatii u ludzi ujawniła złożoność chorób mięśni, a analiza genetyczna ...

Poniższa technika histologiczna przygotowywania skrawków zamrożonych oraz zatopionych w parafinie mięśni klatki piersiowej Drosophila umożliwia zastosowanie skutecznego podejścia do analizy morfologii mięśni i ekspresji białek. Osiąga się to poprzez uprzednią unieruchomienie zwierząt w kołnierzach, a następnie zatopienie tkanki. Tkanki zatopione w parafinie lub medium OCT są następnie cięte za pomocą mikrotomu.Na koniec przekroje barwi się w celu wizualizacji struktur tkanki mięśniowej lub wykrycia różnych komponentów molekularnych mięśni. Uzyskane preparaty, stosowane w połączeniu z klasycznymi metodami barwienia histologicznego, barwnikami fluorescencyjnymi lub barwieniem immunologicznym, pozwalają ukazać morfologię tkanki mięśniowej oraz lokalizację komponentów specyficznych dla mięśni. Główną zaletą tej techniki jest możliwość odzyskania cienkich przekrojów mięśni w konfiguracji występującej naturalnie w organizmie zwierzęcia.Metodę tę można łatwo dostosować do innych układów, takich jak odcinek głowowo-tułowiowy i odwłok Drosophila. Została ona opracowana w laboratorium Heleny Shety, w laboratorium ekspresji genów i sygnalizacji, a zaprezentuje ją dzisiaj Maria Rinko. Na początek należy przygotować wszystkie roztwory do zanurzania kołnierzy w szklanych słoikach do barwienia.Przygotuj świeży utrwalacz Carnoy’a, łącząc absolutny etanol, chloroform i lodowaty kwas octowy w proporcjach odpowiednio sześć do trzech do jednego. Przygotuj stos folii aluminiowej, tworząc kieszenie o odpowiedniej wielkości dla kołnierzy. Przygotuj również roztwory etanolu, metanolu i parafiny w słoikach do barwienia.Teraz umieść pojemniki z benzoesanem metylu i parafiną w inkubatorze ustawionym na 60 do 65 stopni Celsius. Dodatkowo podgrzej więcej parafiny do 60 do 65 stopni Celsius. Aby wlać materiał do kieszonek z folii, przymocuj kołnierz pod mikroskopem za pomocą taśmy w pozycji pionowej, tak aby punkt wejścia dla muchy był widoczny.Znieczul muszki, używając dwutlenku węgla lub poprzez hipotermię z wykorzystaniem bloku lodu. Należy uważać, aby nie zamrozić muszek podczas manipulacji pęsetą. Chwyć poszczególne muszki za skrzydła i umieść każdą z nich w kołnierzu w taki sposób, aby głowa i klatka piersiowa znajdowały się nad ostrzami, a odwłok pod ostrzami.Podczas analizy kilku genotypów umieść od 10 do 20 much w każdym kołnierzyku. Zanotuj numer kołnierzyka oraz odpowiadający mu genotyp. Przenieś kołnierzyk do roztworu Carnoya i utrwal tkankę w temperaturze 4 °C przez noc.Po utrwaleniu należy odwodnić próbkę, zanurzając kołnierz w kolejnych kąpielach etanolu o rosnącym stężeniu na 10 minut każda w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować kołnierz w benzoesianie metylu oraz w roztworze benzoesianu metylu z parafiną przez 30 minut w każdym kroku, a następnie przeprowadzić infiltrację kołnierza w dwóch zmianach parafiny przez 60 minut każda. W temperaturze od 60 do 65 °C szybko przenieść kołnierz do kieszonki z folii.Na tym etapie kołnierz należy umieścić w kieszonkach z folii, aby ułatwić orientację rośliny przy przygotowywaniu przekrojów podłużnych lub poprzecznych. Następnie kieszonki należy wypełnić roztopioną parafiną i odstawić do zastygnięcia. Kieszonki z folii należy pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.Rozwiń z folii suche bloki parafinowe z kołnierzami i delikatnie oddziel kołnierz od bloku parafinowego za pomocą ostrego skalpela. Ostrożnie usuń nadmiar parafiny z okolic tkanki muchy na mikrotomie obrotowym. Wykonaj skrawki z bloku parafinowego z grubością cięcia od 7 do 10 µm.Pozostaw wycięte tkanki do wypłynięcia i rozpłaszczenia w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C. Na koniec nanieś skrawki tkanek na szkiełka polaryzacyjne i pozostaw do wyschnięcia na noc. Szkiełka są teraz gotowe do barwienia hematoksyliną i eozyną.Na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu umieść butelkę z medium do mrożenia odwrócona dnem do góry w lodówce o temperaturze 4 °C, aby ją schłodzić i zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza. Dodatkowo, przygotuj chłodnicę mrożącą o temperaturze -60 °C przy użyciu etanolu i suchego lodu. Podobnie jak w przypadku skrawków parafinowych, unieruchom muchy w kołnierzu, przenieś kołnierz z muchami do uprzednio schłodzonej kieszonki z folii i szybko wypełnij ją związkiem do mrożenia OCT.Pozostaw OCT do całkowitego utwardzenia. Ostrożnie wyjmij uformowany blok z chłodni. Delikatnie oddziel kołnierz od bloku z tkanką i przechowuj go w temperaturze -20 °C przez co najmniej jeden dzień. Następnie, korzystając z mikrotomu kriostatycznego, wykonaj skrawki z zamrożonych mięśni w temperaturze od -15 do -18 °C, przy grubości cięcia od 10 do 15 mikronów.Następnie umieść próbki na szkiełkach polaryzacyjnych. Przechowuj próbki w temperaturze -20°C do czasu dalszego przetwarzania. Krople lipidów można wykryć za pomocą barwienia Oil Red O na sekcjach mrożonych.Stosując protokół zaadaptowany od Sebera i Tuma, należy pamiętać, że bezpośrednio przed barwieniem skrawki mrożone muszą zostać utrwalone w 4% formaldehydzie przez 10 minut. Po utrwaleniu przemyć preparaty wodą dwukrotnie, po pięć minut każdy. Następnie poddać równowagowaniu w glikolu propylenowym przez 10 minut.Następnie inkubować przez trzy godziny w oleju. Barwić czerwienią w temperaturze pokojowej. Po tym czasie przemyć próbki dwukrotnie przez pięć minut w glikolu polipropylenowym, a następnie przez 30 minut w PBS. Osadzić próbki w 30% glicerolu, zabarwić hematoksyliną i eozyną, a następnie wykonać przekroje poprzeczne i podłużne mięśni pośrednich lotnych w celu odróżnienia nieprawidłowego rozmiaru i morfologii od mięśni o prawidłowej strukturze.Przekroje zatopione w parafinie można również skutecznie barwić przeciwciałami, co pokazano w tej sekcji traktu jelitowego drosophila, w którym uwidoczniono marker otoczki jądrowej Lamin C oraz barwienie jądrowe DPI. Tutaj poprzeczne przekroje klatki piersiowej drosophila są barwione przeciwciałem anty-Lamin C oraz DPI, aby przedstawić powiększony widok mięśni prawidłowych i zdegradowanych.Podobnie, podłużne skrawki mrożone mięśni pośrednich lotnych mogą być barwione przeciwciałami przeciwko distro, glikanom mięśniowym, markerom sarkolemy oraz DPI, natomiast w przypadku barwienia Oil Red O, poprzeczne skrawki mrożone klatki piersiowej Drosophila wykazują obecność kropel lipidowych. Połączenie tych technik z innymi metodami, takimi jak barwienie HNE i detekcja immunohistochemiczna, stanowi potężne podejście do określania struktury tkanki i lokalizacji białek w mięśniach.

paraffin-embedded-and-frozen-sections-of-drosophila-adult-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Parafina i zamrożone przekroje Drosophila Dorosłych Mięśni

Mięśnie lotu Drosophila są używane jako modelowy system dla rozwoju i fizjologii mięśni. Ten film opisuje muskulaturę lotu dorosłych osobników i przedstawia protokół analizy rozwijających się pośrednich mięśni lotu, które są odpowiednie do sekwencjonowania RNA z poczwarek.

Drosophila Rozwarstwienie mięśni lotu pośredniego późnej poczwarki (IFM): metoda wysokoprzepustowego pobierania tkanek

Ten film demonstruje protokół oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych w grzbietowych mięśniach podłużnych Drosophila. Procedura polega na barwieniu neuronów i mięśni dwoma odrębnymi przeciwciałami i porównaniu wzorców fluorescencji między muchami zmutowanymi i dzikimi. Zmniejszenie barwienia neuronów u zmutowanych much wskazuje na neurodegenerację, podczas gdy struktura mięśni pozostaje nienaruszona.

Ocena integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych u Drosophila

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Przedstawiamy metodę ilościowego określania powierzchni mięśniowej, która jest pośrednią metodą określania masy mięśniowej u dorosłych Drosophila. Demonstrujemy zastosowanie naszej metodologii, analizując pośrednie mięśnie lotu w modelu Drosophila choroby dystrofii miotonicznej.

Optyczne oznaczanie obszaru mięśni w przekroju poprzecznym dorosłych mięśni lotu pośredniego Drosophila melanogaster

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania regulacji transkrypcji, alternatywnego splicingu, metabolizmu i mechanobiologii. Przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotnych z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek, idealnych do proteomiki i głębokiego sekwencjonowania. Próbki te mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w różne aspekty rozwoju mięśni.

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Opisujemy technikę sekcji, która zachowuje architekturę połączenia nerwowo-mięśniowego i umożliwia szczegółowe badanie immunocytochemiczne neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila.

Rozwarstwienie i immunohistochemia dorosłej nogi Drosophila w celu wykrycia zmian w połączeniu nerwowo-mięśniowym dla zidentyfikowanego neuronu ruchowego

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Poznaj technikę histologiczną przygotowywania zatopionych w parafinie i zamrożonych preparatów mięśni tułowia Drosophila. Metoda umożliwia analizę morfologii mięśni i lokalizacji białek w badaniach biologii mięśni.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

Przeglądaj więcej filmów