Kolejne alejki testują lęk u myszy i szczurów
17 czerwca 2013
Labirynt plusowy mierzy zachowania podobne do lęku u gryzoni. Są dwa przeciwległe zamknięte i dwa przeciwległe otwarte ramiona; Niespokojne gryzonie unikają otwartych ramion. Centralna część nie jest ani do końca otwarta, ani zamknięta, więc czas spędzony tutaj jest niejednoznaczny i trudny do interpretacji. W tym miejscu opisana jest modyfikacja protokołu plus-maze eliminująca ten obszar.
Ogólnym celem poniższego protokołu jest pomiar zachowania podobnego do lęku u gryzoni. Osiąga się to za pomocą specjalnie zaprojektowanego urządzenia zwanego kolejnym aparatem Alla. Aparat kolejnych alejek składa się z szeregu stopniowo zwężających się alejek, które również zmniejszają się pod względem wysokości swoich ścian.
Lękotwórczy charakter alejek nasila się, gdy zwierzę zbliża się do wąskiego otwartego końca, uzyskuje się wyniki, które pokazują zmiany w zachowaniu podobnym do lęku po interwencji genetycznej lub farmakologicznej. Główną zaletą techniki Alego, w przeciwieństwie do istniejących metod, takich jak labirynt z podniesionym plusem, jest to, że nie ma centralnego obszaru, w którym charakter zachowania eksploracyjnego jest raczej niejednoznaczny. Aparat kolejnej alei składa się z czterech liniowo połączonych alejek wykonanych z drewna.
Aleje są zaprojektowane tak, aby w miarę oddalania się od punktu początkowego zyskiwały na swoim niepokoju. Każda alejka ma 25 centymetrów długości. Szerokość każdej alejki stopniowo się zmniejsza.
Podobnie wysokość murów maleje z każdą kolejną alejką. Zacisk mocuje urządzenie do stołu laboratoryjnego, podnosząc je około 50 centymetrów nad podłogą. Otwarty koniec alejki powinien znajdować się w odległości co najmniej 10 centymetrów od podpory, aby myszy nie mogły się na nią wspiąć.
Umieść wyściółkę pod urządzeniem, aby zamortyzować zwierzę, jeśli upadnie. Na początek przynieś myszy do pokoju eksperymentalnego na pięć do 20 minut przed testem aklimatyzacji. Dobrą praktyką podczas monitorowania zachowania na nowym urządzeniu jest najpierw wystawienie go na działanie sody mysiej od zwierzęcia nieeksperymentalnego.
Po wyjęciu zwierzęcia wyczyść aparaturę jak zwykle, zanim przetestujesz gotowe timery, które będą potrzebne do eksperymentu. Połączone zdarzenie, licznik i licznik czasu, jak widać tutaj, działa dobrze. Kiedy będzie gotowy.
Umieść mysz na zamkniętym końcu alejki, przodem do ściany. Natychmiast uruchom licznik czasu, który określi całkowitą długość testu i inny, który rejestruje czas spędzony w alejce pierwszej. Obserwuj zachowania eksploracyjne zwierzęcia i rejestruj opóźnienia wjazdów do wejścia oraz całkowity czas spędzony w kolejnych alejkach, który ma zostać policzony.
Jako wejście, mysz musi umieścić wszystkie cztery stopy na następnej alejce. Kontuzje były uwzględniane, poruszając się zarówno do przodu, jak i do tyłu. Zapisz liczbę boli w kale i czy doszło do oddawania moczu.
Jeśli mysz odpadnie, zatrzymaj zegar i umieść ją w alejce, z której spadła, zwrócona w stronę alejki pierwszej. Po czasie badania wyjmij zwierzę i wyczyść aparat wilgotną szmatką, a następnie suchą chusteczką. Dla każdego zwierzęcia zapisz opóźnienie wejścia do każdej alejki, liczbę wejść do każdej z nich i całkowity czas spędzony w niej.
W tym przykładzie myszy z uszkodzeniami przyśrodkowej kory przedczołowej były testowane w tradycyjnym labiryncie na podwyższonym plusie. Zwierzęta z uszkodzeniami chorobowymi oznaczone przez M spędzały więcej czasu w otwartych ramionach w porównaniu z grupą kontrolną pokazaną tutaj jako grupa C, co sugeruje zmniejszenie lęku w porównaniu z grupą kontrolną. Podobnie, jeśli chodzi o sukces wszystkich urządzeń, zwierzęta z uszkodzeniami testowymi spędzały więcej czasu w najdalszych i najbardziej niespokojnych zakątkach aparatury w porównaniu z grupą kontrolną.
Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak labirynt podwyższony plus, można wykorzystać do dalszego scharakteryzowania zmian w lęku.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zmodyfikowany protokół z wykorzystaniem labiryntu w kształcie krzyża do pomiaru zachowań lękowych u gryzoni. Nowa metoda eliminuje niejednoznaczną strefę centralną występującą w tradycyjnych konstrukcjach labiryntu w kształcie krzyża, co pozwala na jaśniejszą interpretację zachowań eksploracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Modele gryzoni
Wprowadzenie
- Labirynt w kształcie krzyża jest powszechnie stosowanym narzędziem do oceny lęku u gryzoni.
- Tradycyjne konstrukcje zawierają obszar centralny, który utrudnia interpretację behawioralną.
- Eliminacja tego obszaru może zwiększyć przejrzystość wyników.
- Aparat z następującymi korytarzami oferuje nowatorskie podejście do pomiaru zachowań lękowych.
Cel badania
- Opracowanie bardziej skutecznej metody oceny lęku u gryzoni.
- Zapewnienie przejrzystej alternatywy dla testu labiryntu w kształcie krzyża.
- Ułatwienie badania zachowań związanych z lękiem po interwencjach genetycznych lub farmakologicznych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie aparatury z kolejnymi korytarzami o stopniowo zmniejszającej się szerokości.
- Pomiar czasu latencji do wejścia do korytarzy oraz czasu spędzonego w każdym z nich.
- Rejestracja zachowań eksploracyjnych i reakcji fizjologicznych (np. wydalanie kulek kałowych).
- Porównanie zachowania zwierząt z uszkodzeniem mózgu oraz zwierząt z grupy kontrolnej.
Główne wyniki
- Zwierzęta z uszkodzeniami spędziły więcej czasu w otwartych alejkach w porównaniu z grupą kontrolną.
- Zmiany behawioralne były spójne zarówno w tradycyjnym labiryncie w kształcie krzyża, jak i w aparaturze z następującymi po sobie alejkami.
- Nowa aparatura dostarczyła wyraźniejszych informacji na temat zachowań lękowych.
- Wyniki potwierdzają zasadność zastosowania metody następujących po sobie alejek w ocenie lęku.
Wnioski
- Aparat z następującymi korytarzami jest obiecującym narzędziem w badaniach nad lękiem.
- Eliminacja strefy centralnej poprawia interpretację zachowań eksploracyjnych.
- Metoda ta może pogłębić zrozumienie mechanizmów lęku u gryzoni.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Aparat z następczymi alejkami rozwiązuje kluczowy problem w testowaniu lęku u gryzoni poprzez eliminację niejednoznacznego obszaru centralnego w labiryncie w kształcie krzyża, co poprawia przejrzystość odczytów behawioralnych. Udoskonalenie to pozwala na bardziej wiarygodną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnym etapie odkrywania leków, szczególnie podczas potwierdzania fenotypów wynikających z interwencji genetycznych lub farmakologicznych. Metoda ta stanowi komplementacyjny test, który może zwiększyć pewność prognostyczną w programach odkrywania leków związanych z leczeniem lęku.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar zachowań przypominających lęk przy zredukowanej niejednoznaczności interpretacyjnej.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki spójnym odczytom w poszczególnych alejkach, co ułatwia potwierdzenie celu w modelach mutantów.
- Wartość prognostyczna: Oferuje ortogonalną walidację wyników uzyskanych w labiryncie plus, zwiększając pewność co do rezultatów przesiewowych fenotypowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych zmiennych zależnych, takich jak latencja wejścia do alejek oraz czas spędzony w każdej alejce, co umożliwia określenie korelacji dawka-odpowiedź oraz genotyp-fenotyp.
- Wartość operacyjna: Charakteryzuje się prostą, liniową konstrukcją o ustandaryzowanych wymiarach alejek (25 cm długości, malejąca szerokość i wysokość ścian), co sprzyja powtarzalności testu.
- Skalowalność: Dzięki łatwości czyszczenia, konfiguracji oraz standaryzacji między laboratoriami, system może zostać przystosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia spójność z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie cech lękowych, które mają zastosowanie w badaniach nad zaburzeniami neuropsychiatrycznymi.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pomaga odróżnić ogólne zmiany w aktywności lokomotorycznej od specyficznych fenotypów lękowych, gdy jest stosowany wraz z testami komplementarnymi.
- Wsparcie modelu przedklinicznego: Przydatny w programach mutogenezy opartych na ENU, w których dostępne są jedynie pojedyncze przykłady mutantów, dostarczając potwierdzających danych behawioralnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Aparat z sukcesywnymi alejkami wpisuje się w kontinuum procesu badawczego – od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – oferując doprecyzowany odczyt behawioralny, który redukuje szumy w testach eksploracyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację zmiennej niezależnej (pozycja korytarza/gradient anksjogenny) w celu pomiaru zmiennych zależnych, takich jak unikanie eksploracji.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testu dzięki standaryzacji czasu, liczeniu wejść oraz rejestracji odchodów w formie kulek jako wyników ilościowych.
- Analityka: Generuje mierzalne punkty końcowe, takie jak latencja wejścia do korytarza i całkowity czas spędzony, co pomaga porównać warunki w grupach badawczych.
- Badania translacyjne: Wiąże się z trafnością przedkliniczną poprzez potwierdzanie fenotypów związanych z lękiem zaobserwowanych w innych modelach, ograniczając tym samym ryzyko fałszywie dodatnich wyników na dalszych etapach badań.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma behawioralna w wielu projektach dzięki prostej konstrukcji i minimalnym wymaganiom dotyczącym szkolenia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w ocenie zachowań lękowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym wymiarom aparatury i jasnym kryteriom punktacji (np. wymóg wprowadzenia wszystkich czterech łap do korytarza).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie danych potwierdzających, co zmniejsza zależność od wyników pojedynczego testu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków lub celów genetycznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zbieżne fenotypy lękowe w wielu paradygmatach behawioralnych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu neuronauki lub farmakologii behawioralnej, aby interpretować wzorce eksploracyjne i odróżnić lęk od lokomocji.
- Wymagane są standardowe laboratoryjne stoper i liczniki; nie jest potrzebna żadna specjalistyczna aparatura poza drewnianym urządzeniem i systemem mocowania.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie okresów aklimatyzacji (5–20 min), protokołów czyszczenia oraz zasad punktacji w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymagane są dostosowania przy przenoszeniu metody między gatunkami (np. myszy vs szczury) ze względu na różnice w wielkości i progach eksploracyjnych.
- Ograniczeniem jest konieczność ręcznej oceny obserwacyjnej, chyba że metoda zostanie połączona z automatycznymi systemami śledzenia, co może zwiększyć złożoność implementacji.
