Name: Aktywacja apoptozy przez cytoplazmatyczne mikrowstrzyknięcie cytochromu c (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji cytoplazmatycznej cytochromu c do fibroblastów i neuronów w celu badania mechanizmów apoptozy. Technika ta pozwala naśladować uwalnianie cytochromu c z mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu NIH nr NS042197 przyznanego MD. AJK otrzymał wsparcie z grantów T32GM008719 oraz F30NS068006.

1. Wytwarzanie igieł do mikroiniekcji
<ol>
 <li>Gotowe igły do mikroiniekcji są dostępne w sprzedaży (np. Femtotips firmy Eppendorf) i są przydatne, jeśli nie wykonuje się dużej liczby mikroiniekcji. Jednak dla osób chcących stworzyć długoterminowe możliwości mikroiniekcji, alternatywą jest wytwarzanie igieł w laboratorium przy użyciu cienkościennych kapilar z borokrzemianowego szkła i komercyjnego wyciągacza igieł. Pozwala to również na modyfikację kształtu igieł, co może być przydatne w przypadku różnych typów komórek.</li>
 <li>W wyciągaczu igieł do mikroiniekcji Narishige PC-10 zamocuj wszystkie cztery obciążniki i zastosuj jednowykrokowy program wyciągania (ustawienie Step 1) z względnym ustawieniem temperatury na 58.0 (grzałka nr 2). Upewnij się, że element grzejny znajduje się w centrum każdej kapilary, aby dwie otrzymane igły miały podobną długość.</li>
 <li>Wyciągnij kilka kapilar (około 2 kapilar na każde interesujące białko).</li>
 <li>Przechowuj igły w pojemniku, dbając o to, aby nie uszkodzić ich końcówek. W pojemnikach do stabilizacji igieł do mikroiniekcji można zastosować materiały takie jak pianka lub Blu-Tack.</li> 
</ol>
2. Przygotowanie mieszanin białek do iniekcji
<ol>
 <li>Przygotować 10-krotny bufor do mikroiniekcji zawierający 1 M chlorku potasu i 0,1 M bufor fosforanowo-potasowy (KPi) (równomolowa mieszanina K2HPO4 i KH2PO4) o pH 7,4. Bufor ten można przechowywać długoterminowo w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>W celu wizualizacji iniekcji należy dodać barwnik fluorescencyjny, taki jak rodamina-dekstran. Rozcieńczyć 10-krotny bufor do mikroiniekcji w wodzie i rozpuścić proszek rodaminy-dekstranu, aby przygotować 5-krotny roztwór buforu do mikroiniekcji zawierający 20-40 mg/mL rodaminy-dekstranu.</li>
 <li>Przechowywać ten roztwór w ciemności w temperaturze 4°C. Powinien on wystarczyć do przygotowania do 100 oddzielnych porcji roztworów białek. Można zastosować inne barwniki, takie jak izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran.</li>
 <li>Przygotować zapasy cytochromu c, rozpuszczając oczyszczony cytochrom c w wodzie do stężenia 20 mg/mL. Przechowywać cytochrom c w temperaturze -80°C w celu długoterminowego składowania; aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, przechowywać cytochrom c w małych alikwotach (~10 μL).</li>
 <li>Przygotować 10 μL mieszaniny białek do iniekcji, łącząc 2 μL 5-krotnego buforu do mikroiniekcji zawierającego rodaminę-dekstran z 3 μL wody i 5 μL cytochromu c, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/mL cytochromu c w 1-krotnym buforze (100 mM KCl, 10 mM KPi, 4-8 mg/mL rodaminy-dekstranu).</li>
</ol>

3. Cytoplazmatyczna mikroiniekcja cytochromu c
<ol>
 <li>Bezpośrednio przed mikroiniekcją odwirować mieszaninę cytochromu c i buforu do mikroiniekcji przy 16,000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C, aby oddzielić wszelkie cząstki stałe, które mogłyby zapchać igły do mikroiniekcji.</li>
 <li>W czasie wirowania włączyć mikroinjektor, aby umożliwić wzrost ciśnienia powietrza.</li>
 <li>Umieścić naczynie z komórkami na środku stolika mikroskopu i ustawić ostrość na komórkach. Aby zminimalizować czas przebywania komórek poza inkubatorem, zazwyczaj są one do niego zwracane w ciągu 30 min.</li>
 <li>Pipetować 0,5-1 μL z górnej powierzchni mieszaniny białek do tępego końca kapilary. Należy uważać, aby nie pobrać żadnych cząstek, które zostały odwirowane na dno probówki. W ciągu minuty mieszanina białek zostanie rozprowadzona do końcówki igły poprzez działanie kapilarne.</li>
 <li>Mocno przymocować igłę do uchwytu kapilary mikromanipulatora i ustawić igłę tak, aby jej końcówka przechodziła przez światło przechodzące mikroskopu pod kątem około 45°.</li>
 <li>Dostosować położenie końcówki igły tak, aby znajdowała się bezpośrednio w centrum pola widzenia. Aby wycentrować igłę, należy przesuwać ją za pomocą mikromanipulatora, patrząc przez okular mikroskopu. Powinien być widoczny cień igły. Ustawić igłę tak, aby jej cień był widoczny tylko w jednej połowie pola widzenia, co wskazuje, że końcówka igły jest wycentrowana nad komórkami.</li>
 <li>Ustawić mikroinjektor w tryb przepływu ciągłego (Continuous Flow) i ustawić ciśnienie robocze na 20 - 100 hPa. Każda igła może wymagać innego ciśnienia roboczego, a ciśnienie to będzie prawdopodobnie wymagało regulacji podczas procedury mikroiniekcji w celu utrzymania stałego przepływu.</li>
 <li>Obniżyć igłę za pomocą pokrętła grubościowego do pozycji tuż nad komórkami. Aby to zrobić, należy podnieść płaszczyznę ogniskową mikroskopu do pozycji tuż nad komórkami. Następnie obniżyć igłę w kierunku komórek za pomocą pokrętła grubościowego, aż końcówka igły znajdzie się w ostrości.</li>
 <li>Ponownie wycentrować końcówkę igły w polu widzenia i zwiększyć powiększenie, zmieniając obiektyw mikroskopu.</li>
 <li>Powoli obniżać igłę za pomocą precyzyjnego pokrętła manipulatora, aż igła znajdzie się nieco powyżej płaszczyzny ogniskowej komórek.</li>
 <li>Sprawdzić przepływ mieszaniny białek, obserwując czerwoną fluorescencję rodaminy. Mieszanina białek powinna wypływać z igły w postaci cienkiego, stałego strumienia. Igły należy wymienić i ponownie napełnić, jeśli igła zostanie uszkodzona lub jeśli przepływ jest zbyt silny. Czasami końcówka szklanej kapilary jest zamknięta i nie widać przepływu z igły. W takim przypadku należy wymienić igłę lub ostrożnie opuścić ją na dno naczynia hodowlanego, aby delikatnie przerwać końcówkę igły.</li>
 <li>Ustawić końcówkę igły tak, aby była skierowana w stronę komórki pod kątem około 45°. Następnie jednym płynnym ruchem opuścić igłę, przesuwając ją w stronę komórki. Drugim płynnym ruchem natychmiast zmienić kierunek ruchu igły, aby wycofać ją z komórki.</li>
 <li>Prawidłowo iniektowana komórka często lekko puchnie, co można potwierdzić poprzez wizualizację czerwonej fluorescencyjnej rodaminy wewnątrz komórki. Sporadycznie może dojść do przypadkowej iniekcji do jądra komórkowego, co będzie widoczne.</li>
 <li>Kontynuować iniekcję komórek, regulując stolik mikroskopu, aż zostanie zainiektowanych około 50-100 komórek. Podczas przesuwania stolika mikroskopu należy pamiętać o podniesieniu igły do mikroiniekcji, aby nie dotykała ona wierzchołków komórek.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Cytoplazmatyczna mikroiniekcja cytochromu c naśladuje jego uwalnianie z mitochondriów podczas apoptozy. W związku z tym, zgodnie z oczekiwaniami, fibroblasty szybko ulegają apoptozie po cytozolowej mikroiniekcji wołowego cytochromu c (Ryc. 1A). Aby upewnić się, że sama procedura iniekcji nie jest odpowiedzialna za śmierć komórek, jako istotną kontrolę zastosowano iniekcję drożdżowego cytochromu c, ponieważ cytochrom c z drożdży nie jest w stanie aktywować kaspaz12.
Ciekawym spostrzeżeniem jest to, że postmitotyczne neurony współczulne wykazują niezwykłą odporność na cytosolowy cytochrom c (Rys. 1B)8,13. Nasz zespół badawczy zidentyfikował endogenny inhibitor kaspazy XIAP jako kluczowy inhibitor aktywacji kaspaz w neuronach14. Zatem, aby neurony mogły obumrzeć po wstrzyknięciu cytochromu c, XIAP musi najpierw ulec inaktywacji. Na przykład mikrowstrzyknięcie cytochromu c do neuronów współczulnych xiap-/- jest wystarczające, aby doprowadzić do aktywacji kaspaz i apoptozy w tych komórkach (Rys. 2).
<img src="/files/ftp_upload/2773/2773fig1.jpg" alt="Obrazowanie komórek przedstawiające MEF-y typu dzikiego i neurony z cyt c + Rodaminą, obraz fazowy, nałożenie w czasie 0-24 h." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Cytoplazmatyczna mikroiniekcja cytochromu c indukuje szybką śmierć w fibroblastach, ale nie w neuronach. A) MEF-y typu dzikiego lub (B) neurony współczulne typu dzikiego w 5. dniu po urodzeniu poddano mikroiniekcji bydlęcego cytochromu c (10 mg/mL) wraz z dekstranem rodaminowym w celu oznaczenia wstrzykniętych komórek. Obrazy przedstawiają to samo pole komórek bezpośrednio po iniekcji (0 h) lub w określonych punktach czasowych. Strzałki wskazują wstrzyknięte komórki. Pasek skali, 20 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2773/2773fig2.jpg" alt="Równowaga statyczna w obrazowaniu neuronowym, wyniki mikroskopowe, neurony XIAP KO, test cyt c Rhodamine." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Neurony z niedoborem XIAP są podatne na mikroiniekcję cytoplazmatyczną cytochromu c. Neurony współczulne z 5. dnia postnatalnego myszy z nokautem XIAP poddano mikroiniekcji wołowego cytochromu c (10 mg/mL) wraz z rodaminą-dekstranem w celu znakowania wstrzykniętych komórek. Obrazy przedstawiają to samo pole komórek bezpośrednio po iniekcji (0 hr) lub 5 godzin po mikroiniekcji cytochromu c (5 hr). Pasek skali, 20 μm.

<ol><li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%3A+critical+control+points%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116, 205-219 (2004).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+role+of+mitochondria+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The expanding role of mitochondria in apoptosis.</a> Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).</li>
<li>Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of apoptosis.</a> Nature. 407, 770-776 (2000).</li>
<li>Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+structures+that+shape+caspase+activity%2C+specificity%2C+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition.</a> Biochem. J. 384, 201-232 (2004).</li>
<li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cell+death%3A+outer+membrane+permeabilization+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li>
<li>Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induced+by+microinjection+of+cytochrome+c+is+caspase-dependent+and+is+inhibited+by+Bcl-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2.</a> Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).</li>
<li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+induction+of+apoptosis+by+microinjection+of+cytochrome+c.+Bcl-XL+has+activity+independent+of+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release.</a> J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).</li>
<li>Deshmukh, M., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+novel+event+during+neuronal+death%3A+development+of+competence-to-die+in+response+to+cytoplasmic+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c.</a> Neuron. 21, 695-705 (1998).</li>
<li>Vaughn, A. E., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+inhibits+apoptosis+in+neurons+and+cancer+cells+by+redox+inactivation+of+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).</li>
<li>Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+apoptosis+by+Bcl-2%3A+release+of+cytochrome+c+from+mitochondria+blocked%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.</a> Science. 275, 1129-1132 (1997).</li>
<li>Gonzales, D. H., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+mitochondrial+c-type+cytochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes.</a> J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).</li>
<li>Ellerby, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+cell-free+system+of+neuronal+apoptosis+-+comparison+of+premitochondrial%2C+mitochondrial%2C+and+postmitochondrial+phases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases.</a> J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).</li>
<li>Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+cytochrome+c+activity+within+intact+neurons+inhibits+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis.</a> J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).</li>
<li>Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li>
<li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death%3A+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li>
</ol>

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Karoliny Północnej.

Mikroiniekcja cytochromu c bezpośrednio do cytoplazmy komórek jest wyjątkowym i potężnym narzędziem, które umożliwia badanie pozymitochondrialnej regulacji apoptozy. Co istotne, technika ta pozwala na bezpośrednią aktywację apoptozy poniżej poziomu mitochondriów, bez konieczności stosowania czynników powodujących uszkodzenia komórkowe lub mitochondrialne.
Choć niniejszy protokół koncentruje się na mikroiniekcji cytochromu c na potrzeby badań nad apoptozą, przedstawione tutaj ...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop odwrócony DM IRE2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikroigieł PC-10</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator MWO-202</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne kapilary borokrzemianowe z mikrofilamentem</td><td>A-M Systems</td><td>615000</td><td>długość 4 inch, średnica zewnętrzna 1,00 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm</td></tr><tr><td>Rodamina B izotiocyjaniano-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>Średnia masa cząsteczkowa ~70,000 Da</td></tr><tr><td>Bydli białko cytochrom &lt;em&gt;c&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3131</td><td></td></tr></tbody></table>

aktywacja apoptozy poprzez cytoplazmatyczną mikroiniekcję cytochromu c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptoza, czyli programowana śmierć komórki, jest konserwowaną i ściśle regulowaną ścieżką, poprzez którą komórki obumierają1. Apoptoza może zostać wywołana, gdy komórki napotkają szeroki zakres stresów cytotoksycznych. Bodźce te inicjują kaskady sygnalizacyjne, które ostatecznie prowadzą do uwalniania cytochromu c z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów do cytoplazmy2. Uwolnienie cytochromu c z mitochondriów jest kluczowym zdarzeniem, które wyzwala szybką aktywację kaspaz — głównych komórkowych proteaz, które ostatecznie przeprowadzają śmierć komórki3-4.
Szlak apoptozy jest regulowany w punktach znajdujących się przed oraz po uwalnianiu cytochromu c z mitochondriów5. W celu zbadania regulacji aktywacji kaspaz po etapie mitochondrialnym, wielu badaczy zdecydowało się na bezpośrednią mikroiniekcję cytoplazmatyczną białka holocytochromu c (z przyłączoną hemą) do komórek6-9. Cytochrom c jest zazwyczaj zlokalizowany w mitochondriach, gdzie przyłączenie grupy hemowej jest niezbędne do aktywacji apoptozy10-11. Z tego względu, aby bezpośrednio aktywować kaspazy, konieczne jest wstrzyknięcie białka holocytochromu c zamiast jego cDNA, ponieważ choć ekspresja cytochromu c z konstruktów cDNA doprowadzi do ukierunkowania na mitochondria i przyłączenia hemy, białko to zostanie odizolowane od kaspaz cytozolowych. Tym samym bezpośrednia mikroiniekcja cytozolowa oczyszczonego białka cytochromu c z przyłączoną hemą jest użytecznym narzędziem do naśladowania uwalniania cytochromu c z mitochondriów i apoptozy bez konieczności stosowania toksycznych czynników powodujących uszkodzenia komórkowe i mitochondrialne.
W niniejszym artykule opisujemy metodę mikroiniekcji białka cytochromu c do komórek, wykorzystując jako przykłady embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) oraz pierwotne neurony współczulne. Choć niniejszy protokół koncentruje się na iniekcji cytochromu c w celu badania apoptozy, przedstawione tutaj techniki można łatwo dostosować do mikroiniekcji innych interesujących białek.

W niniejszym protokole opisujemy bezpośrednią mikroiniekcję cytoplazmatyczną białka cytochromu c do fibroblastów oraz pierwotnych neuronów współczulnych. Technika ta umożliwia wprowadzenie białka cytochromu c do cytoplazmy komórek i naśladuje uwalnianie cytochromu c z mitochondriów, które zachodzi podczas apoptozy.

Aktywacja apoptozy poprzez cytoplazmatyczną mikroiniekcję cytochromu c

Apoptoza, czyli programowana śmierć komórki, to konserwatywna i ściśle regulowana ścieżka, w wyniku której dochodzi do śmierci komórek1. Apoptoza może zostać wywołana, gdy komórki napotkają...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie białka cytochromu C do cytoplazmy komórek, aby naśladować uwalnianie cytochromu C z mitochondriów podczas apoptozy. Osiąga się to poprzez przygotowanie mieszaniny rekombinowanego białka cytochromu C z barwnikiem, takim jak rodaminowy dekstran. Mieszaninę białkową poddaje się wirowaniu w celu oddzielenia małych cząstek, które mogłyby zapchać igłę.Drugim krokiem procedury jest ustawienie igły nad kulturą komórek na stole mikroskopu. Następnie do komórek wstrzykuje się mikroiniekcyjnie roztwór zawierający cytochrom C. Po mikroinjekcji monitoruje się przeżywalność komórek; ostatecznie komórki wykazują różną wrażliwość na cytochrom C. Na przykład fibroblasty reagują szybką apoptozą, podczas gdy neurony są niezwykle odporne na ten bodziec.Wyjątkową cechą tej techniki w porównaniu z traktowaniem komórek lekami indukującymi apoptozę jest to, że cytoplazmatyczna mikroiniekcja cytochromu C indukuje apoptozę bez powodowania uszkodzeń mitochondriów. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie apoptozy, takie jak to, czy komórki różnie regulują apoptozę w etapach następujących po uwalnianiu cytochromu C. Należy rozpocząć od przygotowania roztworu zapasowego 10 x buforu do mikroiniekcji.Roztwór ten zawiera 1 M chlorku potasu oraz 0,1 M bufor fosforanowy potasu o pH 7,4. Długotrwałe przechowywanie tego buforu może odbywać się w temperaturze pokojowej. Aby zwizualizować wstrzyknięcie, należy dodać barwnik fluorescencyjny, taki jak R Domine dextran.Przygotować 200 µL zapasu 5x barwionego buforu do mikroiniekcji, rozpuszczając proszek Rodamine dextran w 100 µL wody, a następnie mieszając go ze 100 µL 10x roztworu zapasowego buforu do mikroiniekcji. Przechowywać ten roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C.Powinno to wystarczyć do przygotowania do 100 roztworów białek. Inne barwniki, takie jak izotiocyjanian fluoresceiny, mogą zastąpić dekstran. Należy przygotować zapasy cytochromu C, rozpuszczając oczyszczony cytochrom C w wodzie wolnej od DNaz, RNaz i proteaz do stężenia 20 mg/mL.Podziel roztwór zapasowy na alikwoty po 10 µL i przechowuj je w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania. Następnie przygotuj 10 µL mieszaniny do iniekcji, łącząc 2 µL 5x buforu do mikroiniekcji z 3 µL wody i 5 µL cytochromu C, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/mL cytochromu C w buforze 1x.Przechowywać mieszaninę do wstrzykiwania w lodzie i przystąpić do wstrzyknięcia bezpośrednio przed mikroiniekcją; odwiruj przygotowany bufor do wstrzykiwania, aby oddzielić wszelkie cząstki stałe, które mogłyby zapchać igły do mikroiniekcji podczas wirowania. Włącz mikroinjektor, aby umożliwić wzrost ciśnienia powietrza. Igły do mikroiniekcji można wykonać z kapilar lub nabyć komercyjnie pod mikroskopem.Użyj obiektywu 10x, aby ustawić ostrość na komórkach przeznaczonych do iniekcji. Komórki powinny pozostawać poza inkubatorem na czas iniekcji maksymalnie przez 30 minut. Następnie ostrożnie pobierz pipetą od 0,5 do 1 µL mieszaniny białek z powierzchni, aby uniknąć pobrania cząsteczek odwirowanych na dno.Następnie pipetą przenieś mieszaninę białek do tępego końca igły do mikroinkubacji. W ciągu minuty mieszanina białek rozprowadzi się do czubka igły dzięki działaniu kapilarnemu. Następnie mocno zamocuj igłę w mikromanipulatorze i ustaw ją tak, aby jej czubek znajdował się w świetle przechodzącym mikroskopu.Ustaw końcówkę igły pod kątem około 45 stopni tak, aby znajdowała się ona dokładnie w centrum pola widzenia. Cień igły powinien być widoczny w jednej połowie pola widzenia, co wskazuje, że końcówka igły jest wycentrowana nad komórkami. Po ustawieniu mikroinjektora w odpowiedniej pozycji przełącz go w tryb przepływu ciągłego i ustaw ciśnienie robocze w zakresie od 20 do 100 Hector Pascals.Każda igła może wymagać innego ciśnienia roboczego i prawdopodobnie będzie potrzebowała regulacji w trakcie procedury mikroiniekcji. Aby utrzymać stały przepływ, należy teraz podnieść płaszczyznę ogniskowania mikroskopu do pozycji tuż nad komórkami. Następnie należy opuszczać igłę w stronę komórek, aż końcówka igły znajdzie się w obszarze ostrości.Ponownie wycentruj końcówkę igły w polu widzenia i przełącz na obiektyw 40 x. Używając pokrętła manipulatora precyzyjnego, powoli opuszczaj igłę, aż znajdzie się tuż nad komórkami. Następnie sprawdź przepływ mieszaniny białek, obserwując czerwoną fluorescencję domeny pręcikowej.Mieszanina białek powinna wypływać z igły w postaci cienkiego, stałego strumienia. Jeśli z igły nie wypływa ciecz, należy ostrożnie opuścić igłę na dno naczynia hodowlanego, aby delikatnie przebić jej zator. Wskazówka: jeśli strumień będzie zbyt silny, komórki ulegną rozerwaniu podczas wstrzykiwania.W takim przypadku należy zmniejszyć ciśnienie robocze lub wymienić igłę. Po ustaleniu przepływu skieruj igłę w stronę komórki.Następnie jednym płynnym ruchem obniż następę, przesuwając ją w stronę komórki drugim płynnym ruchem. Natychmiast zmień kierunek ruchu igły i wyjmij ją z komórki. Prawidłowo wstrzyknięta komórka może lekko spuchnąć, a w jej cytoplazmie powinny być widoczne czerwone fluorescencyjne pręciki dominy.Sporadycznie podczas przemieszczania się między komórkami może dojść do przypadkowej iniekcji do jądra komórkowego. Należy pamiętać o podniesieniu igły do mikroiniekcji przed przesunięciem stolika. W przeciwnym razie igła może uderzyć w górną część komórek.Po opanowaniu tej techniki, w ciągu 30 minut można wstrzyknąć od 50 do 100 komórek. Przedstawiono tutaj embrionalne fibroblasty mysie z wstrzykniętym cytochromem C. Wstrzyknięcie cytochromu C naśladuje jego uwalnianie z mitochondriów podczas apoptozy, dlatego już po jednej godzinie komórki te uległy obkurczeniu i wykazują pęcherzykowanie błony komórkowej. W konsekwencji komórki te oddzieliły się od naczynia hodowlanego.W przeciwieństwie do nich, neurony współczulne wykazują niezwykłą odporność na wstrzykiwanie cytochromu C i nie ulegają apoptozie po 24 godzinach. Komórki te wyglądają tak samo jak neurony w grupie kontrolnej. Jednak neurony z niedoborem XIAP są wrażliwe na wstrzyknięcie cytochromu C; pięć godzin po wstrzyknięciu neurony te obumierają i nie są już widoczne w hodowli.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób wprowadzać cytochrom C bezpośrednio do cytoplazmy komórek.

activation-of-apoptosis-by-cytoplasmic-microinjection-of-cytochrome-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aktywacja Apoptozy przez Mikroiniekcję Cytoplazmatyczną Cytochromu c

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Zsyntetyzowaliśmy nowy analog pancratystatyny o przeciwnowotworowej aktywności porównywalnej z natywną pancratystatyną; co interesujące, leczenie skojarzone z tamoksyfenem doprowadziło do drastycznego nasilenia indukcji apoptozy i autofagii poprzez celowanie w mitochondria, przy minimalnym wpływie na nienowotworowe fibroblasty. W związku z tym JCTH-4 w połączeniu z tamoksyfenem może stanowić bezpieczną terapię przeciwnowotworową.

Wzmocnienie indukcji apoptozy i autofagii przez nowy syntetyczny analog C-1 7-deoksypancratystatyny w ludzkich komórkach gruczolakoraka piersi i neuroblastoma w połączeniu z tamoksyfenem

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół zastosowania rodaminy 123 do identyfikacji potencjału błony mitochondrialnej (MMP) i badania indukowanej przez CLIC4 apoptozy komórek HN4 in vitro. Pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym i konfokalnym laserowym skaningowym mikroskopem fluorescencyjnym zarejestrowano zmianę MMP w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych oraz analizy skuteczności efferocytozy i specyficznego blokowania apoptotycznych tymocytów za pośrednictwem inhibitorów. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w usuwaniu innych cząstek, w tym sztucznych kulek i bakterii, za pośrednictwem komórek.

Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Poznaj metodę mikroiniekcji cytoplazmatycznej cytochromu c do fibroblastów i neuronów w celu badania mechanizmów apoptozy. Technika ta pozwala naśladować uwalnianie cytochromu c z mitochondriów.

Aktywacja apoptozy poprzez cytoplazmatyczną mikroiniekcję cytochromu c

Przeglądaj więcej filmów