Model hodowli tratwy 3D przełyku: technika hodowli in vitro do generowania modelu błony śluzowej przełyku

Model ludzkiej błony śluzowej przełyku składa się z ludzkich fibroblastów i komórek nabłonkowych wyhodowanych na rusztowaniu przełyku pochodzenia zwierzęcego.

Aby przygotować model 3D tratwy ludzkiego przełyku, zacznij od pobrania sterylnego rusztowania przełyku wstępnie poddanego obróbce w celu usunięcia jego natywnych komórek. Umieść rusztowanie stroną podśluzówkową do góry w dołku hodowlanym.

Następnie umieść pierścień ze stali nierdzewnej na rusztowaniu. W pierścieniu wysiewaj zawiesinę komórek ludzkiego fibroblastu. Następnie dozować pożywkę fibroblastową wokół pierścienia i inkubować. Pierścień ogranicza fibroblasty na powierzchni podśluzówkowej, ułatwiając ich przyleganie.

Teraz zdejmij pierścień, dodaj świeże podłoże, aby zanurzyć rusztowanie i inkubuj. Fibroblasty namnażają się, tworząc wielowarstwowy arkusz komórek, który wydziela niezbędne kofaktory.

Następnie odwróć rusztowanie błoną śluzową do góry i umieść na nim pierścień ze stali nierdzewnej. Zasiać zawiesinę komórek nabłonka ludzkiego w pierścieniu i dodać pożywkę hodowlaną. Inkubować, aby ograniczone komórki nabłonka przylegały do powierzchni błony śluzowej.

Następnie zdejmij pierścień i dodaj nowy nośnik. Inkubuj w celu dyfuzji kofaktorów wytwarzanych przez fibroblasty przez rusztowanie i promowania proliferacji komórek nabłonka.

Teraz, za pomocą metalowej siatki, podnieś rusztowanie, aby wystawić proliferujące komórki nabłonka na granicę powietrzno-cieczową. Pozwala to na całkowite dojrzewanie kultury do modelu ludzko-przełykowego.

Przygotowanie modelu błony śluzowej przełyku należy rozpocząć od ponownego nawodnienia kawałków rusztowania wieprzowego, które były sterylizowane glicerolem przez co najmniej cztery miesiące w 100 mililitrach sterylnego PBS przez pięć 10-minutowych mieszań, zastępując supernatant świeżym PBS przy każdym myciu.

Po piątym mieszaniu przetestuj sterylność rusztowania za pomocą nocnej inkubacji w 100 mililitrach DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka przenieś rusztowania do pojedynczych studzienek z 6-dołkową płytką, podśluzówkową stroną do góry. Następnie umieść sterylny pierścień ze stali nierdzewnej klasy medycznej na środku każdego rusztowania i użyj sterylnych kleszczyków, aby delikatnie docisnąć pierścienie, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie z tkanką.

Dodaj 5 razy 10 do piątych ludzkich fibroblastów przełyku w 0,2 mililitra pożywki fibroblastowej do środka każdego pierścienia. Następnie zalej obszar wokół zewnętrznej strony pierścienia co najmniej dwoma dodatkowymi mililitrami pożywki fibroblastów i inkubuj rusztowania w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Po 24 godzinach usuń pierścienie i zastąp podłoże w każdej studzience co najmniej 5 mililitrami świeżego podłoża fibroblastowego, uważając, aby rusztowania były całkowicie zanurzone. Po tygodniu wyrzuć pożywkę i użyj kleszczy, aby odwrócić rusztowania, powierzchnią błony śluzowej do góry. Umieść pierścienie z powrotem na rusztowaniach, a następnie dodaj 1 razy 10 do szóstych komórek nabłonka w 0,2 mililitra pożywki kompozytowej I do środka każdego pierścienia.

Zalej obszar na zewnątrz pierścienia około 2 mililitrami pożywki kompozytowej I i włóż konstrukty z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach usuń pierścienie i zastąp podłoże w każdej studzience co najmniej 5 mililitrami świeżego podłoża kompozytowego I, upewniając się, że rusztowania są całkowicie zanurzone. Po kolejnych 24 godzinach zastąp pożywkę co najmniej 5 mililitrami pożywki Composite Medium II.

Czwartego dnia umieść sterylne siatki siatkowe ze stali nierdzewnej klasy medycznej w dołkach nowej 6-dołkowej płytki i przenieś konstrukcje na siatki, śluzówką do góry. Na koniec dodaj tyle podłoża kompozytowego III, aby dotarło do spodu kompozytu, pozostawiając powierzchnię wystawioną na działanie powietrza, upewniając się, że próbka jest utrzymywana na granicy faz powietrze-ciecz.