Test rozgałęzień glikogenu w celu zmierzenia stopnia rozgałęzienia glikogenu

Rozgałęzione polisacharydy, takie jak glikogen, zawierają reszty glukozy połączone liniowo wiązaniami alfa-1,4-glikozydowymi i w gałęziach wiązaniami alfa-1,6-glikozydowymi.

Aby określić stopień rozgałęzienia polisacharydów, zacznij od wodnego odczynnika barwiącego zawierającego jodek potasu, jod i chlorek wapnia. W warunkach wodnych jodek potasu i jod dają jony jodkowe.

W oddzielnych probówkach do mikrowirówek wymieszać odczynnik z polisacharydami o znanych strukturach rozgałęzionych i próbką glikogenu o niescharakteryzowanej strukturze.

Polisacharydy przyjmują struktury spiralne poprzez swoje wiązania alfa-1,4-glikozydowe. Jony jodkowe wiążą się z tym spiralnym rdzeniem, tworząc liniowe łańcuchy polijodkowe. Powoduje to tworzenie się kompleksu charge-transfer między polisacharydami a łańcuchami polijodku, w wyniku czego powstają kolorowe kompleksy polisacharyd-jodek.

Nierozgałęzione polisacharydy z dłuższymi łańcuchami polijodkowymi rozwijają niebieski kolor, podczas gdy rozgałęzione polisacharydy z krótszymi łańcuchami polijodkowymi rozwijają kompleksy żółtawe do pomarańczowo-brązowych. Chlorek wapnia zawarty w odczynniku intensyfikuje złożony kolor.

Przenieś mieszaninę do jednorazowych kuwet. Za pomocą spektrofotometru zmierz widmo absorbancji od 330 do 800 nanometrów.

Nierozgałęzione kompleksy o niebieskim kolorze pochłaniają światło na dłuższych falach, wykazując przesunięcie maksimów absorbancji w prawo. W przeciwieństwie do tego, rozgałęzione kompleksy pochłaniają światło na krótszych długościach fal, przy czym przesunięcie maksimów absorbancji w lewo wskazuje na większe rozgałęzienie struktury.

Maksima absorbancji niescharakteryzowanej próbki glikogenu na głębokości około 450 nanometrów potwierdzają jej rozgałęzioną strukturę.

Aby określić rozgałęzienie glikogenu, połącz 650 mikrolitrów odczynnika barwiącego jod/chlorek wapnia ze 100 mikrolitrami wody w 1,5-mililitrowej probówce i dokładnie wymieszaj roztwór przed przeniesieniem do jednorazowej kuwety z metakrylanu. Umieść kuwetę w spektrofotometrze, aby przeprowadzić przebieg w trybie skanowania długości fali w celu zebrania widma tła od 330 do 800 nanometrów.

W osobnej probówce o pojemności 1,5 mililitra połącz 650 mikrolitrów roboczego odczynnika barwiącego jod/chlorek wapnia z 50 mikrogramami glikogenu ostrygowego i uzupełnij końcową objętość do 750 mikrolitrów wodą. Po dokładnym wymieszaniu mieszaniny przenieś roztwór do jednorazowej kuwety z metakrylanem, aby zebrać widmo absorpcyjne od 330 do 800 nanometrów.

Podobnie, uzyskaj widmo absorpcji z 50 mikrogramami amylopektyny i 30 mikrogramami amylozy, jak opisano wcześniej.

Aby uzyskać wskazanie rozgałęzionej struktury niescharakteryzowanej próbki glikogenu, połącz od 25 do 50 mikrogramów glikogenu z 650 mikrolitrami roboczego odczynnika barwiącego jod/chlorek wapnia i postępuj zgodnie z wcześniejszymi wyjaśnieniami w celu uzyskania widma absorpcji.