5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Metylacja DNA to modyfikacja epigenetyczna, która polega na dodaniu grupy metylowej do zasady cytozynowej DNA w celu wytworzenia 5-metylocytozyny. Ta modyfikacja zmienia ekspresję genu.

Aby określić ilościowo metylację DNA za pomocą dot-blot, należy pobrać próbki genomowego DNA pochodzące z ludzkich chondrocytów na różnych etapach dedyferencjacji, które wykazują różne poziomy metylowanej cytozyny.

Potraktuj próbki DNA wodorotlenkiem sodu - silną zasadą - i podgrzej je. Zabieg ten zrywa wiązania wodorowe między dwiema niciami DNA, powodując denaturację DNA. Dodaj octan amonu, aby zneutralizować zasadę, zapobiegając nadmiernej degradacji DNA.

Weź nylonową membranę i umieść zdenaturowane próbki DNA jako kropki. Ujemnie naładowany DNA wiąże się z dodatnio naładowaną membraną nylonową poprzez oddziaływania elektrostatyczne, co powoduje jego zabrudzenie na stałym podłożu.

Potraktuj osuszoną błonę buforem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Następnie dodaj przeciwciała anty-5-metylocytozyny do błony i inkubuj. Przeciwciała te wiążą się wyłącznie z metylowaną cytozyną na DNA.

Przemyć, aby usunąć niezwiązane przeciwciała i dodać chemiluminescencyjne przeciwciała drugorzędowe sprzężone z enzymami, które specyficznie wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Dodaj podłoże chemiluminescencyjne na membranę. Enzym na przeciwciałie reaguje z substratem, tworząc chemiluminescencję - dając kropki o różnej intensywności.

Zobrazuj błonę i zmierz intensywność kropek, która odpowiada zakresowi metylacji DNA w każdej próbce.

Rozpocznij tę procedurę od denaturacji wyizolowanego DNA w 0,1-molowym wodorotlenku sodu przez 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Zneutralizuj DNA za pomocą 1 molowego octanu amonu na lodzie, a następnie rozcieńcz dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną.

Najważniejszym krokiem w plamie punktowej jest plamienie próbek na membranie, rób to powoli i ostrożnie. Staraj się zminimalizować każdy zauważony obszar do 3 do 4 milimetrów średnicy.

Używając końcówki pipety z wąskimi ustami, ostrożnie nanieś 2 mikrolitry seryjnie rozcieńczonego genomowego DNA na dodatnio naładowaną nylonową membranę w środku siatki. Osusz membranę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał, mocząc membranę w 5% BSA w TBST na 10-centymetrowej szalce Petriego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem.

Po 1 godzinie umyj membranę trzy razy w TBST przez 5 minut za każdym razem. Inkubować błonę z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-5-metylocytozyny w TBST w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj membranę trzy razy w TBST przez 5 minut za każdym razem.

Następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym — immunoglobuliną przeciw-mysią G owcom sprzężoną z peroksydazą chrzanową w TBST przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po umyciu membrany w TBST jak poprzednio, dodać substrat enzymatyczny do membrany i inkubować przez 5 do 10 minut. Na koniec zwizualizuj sygnał przeciwciała wtórnego za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta.