Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych

Zacznij od chorobotwórczego rekombinowanego wirusa grypy z genomem zmodyfikowanym w celu włączenia zwartych genów reporterowych.

Te geny reporterowe kodują mały enzym bioluminescencyjny lucyferazy i monomeryczne białko fluorescencyjne.

Zaszczepić wirusa donosowo znieczulonej myszy, odpowiednio ogolonej do późniejszego obrazowania.

Wirus wnika do komórki gospodarza i uwalnia swoją zawartość genetyczną.

Wewnątrz jądra genom wirusa ulega transkrypcji na cząsteczki mRNA, a następnie ulega translacji, aby wytworzyć lucyferazy i białko fluorescencyjne w komórce gospodarza.

Wstrzyknąć substrat lucyferyny retro-orbitalnie do myszy.

Enzym lucyferazy utlenia lucyferynę do oksylucyferyny, która po relaksacji emituje sygnał bioluminescencyjny.

Zmierz sygnał, aby oszacować poziom lucyferazy, umożliwiając monitorowanie infekcji wirusowej u żywego zwierzęcia.

W przypadku analizy ex vivo należy wyciąć płuca i wychwycić sygnał fluorescencyjny za pomocą odpowiedniej techniki obrazowania.

W przeciwieństwie do zwykłych wariantów, monomeryczne białka fluorescencyjne nie tworzą agregatów, co daje wyraźny obraz umożliwiający dokładne śledzenie infekcji wirusowej.

Aby zarazić myszy, zacznij od przygotowania ptasiej grypy w 1X PBS. Utrzymuj wirusa na lodzie do momentu zaszczepienia. Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palca u nogi, aby upewnić się, że mysz jest znieczulona, i zaszczep ją donosowo przygotowanym rozcieńczeniem na ptasią grypę. Upewnij się, że wszystkie myszy oddychają prawidłowo, zanim włożysz je z powrotem do klatek.

Otwórz oprogramowanie do obrazowania i naciśnij przycisk Zainicjuj, a następnie ustaw parametry, które będą używane do obrazowania. Aby monitorować myszy zarażone ptasią grypą, należy ogolić ich klatkę piersiową, aby poprawić wykrywanie sygnału bioluminescencyjnego.

Gdy myszy zostaną znieczulone, użyj igły o rozmiarze 22, aby retroorbitalnie podać 100 mikrolitrów substratu lucyferazy NLuc rozcieńczonego od 1 do 10 w PBS. Natychmiast po wstrzyknięciu należy umieścić zwierzęta w komorze izolacyjnej klatką piersiową skierowaną do góry, a następnie umieścić komorę izolacyjną w przyrządzie do obrazowania, zamknąć drzwi i uzyskać obrazy.

Po zobrazowaniu wróć myszy do ich klatek i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją. Użyj narzędzia ROI oprogramowania do obrazowania, aby przeanalizować uzyskane dane bioluminescencyjne, wyznaczając obszar zainteresowania i klikając przycisk Zmierz.

Aby wykonać obrazowanie ex vivo płuc myszy, należy pobrać płuca zgodnie ze wskazówkami rękopisu, uruchomić oprogramowanie do akwizycji obrazu i ustawić parametry obrazowania. Po zainicjowaniu urządzenia umieść płuca na czarnym tle i upewnij się, że tkanki są od siebie oddzielone. Włóż tacę do termowizora, zamknij drzwiczki i uzyskaj obrazy.

Po zobrazowaniu należy natychmiast usunąć tkanki i przechowywać je na lodzie w temperaturze 4 stopni Celsjusza, jeśli próbki będą przetwarzane tego samego dnia. Jeśli będą przetwarzane później, zamroź je szybko w tubie na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przetworzyć obrazy, wybierz narzędzie ROI, narysuj obszary zainteresowania wokół każdego z poszczególnych płuc i kliknij przycisk Zmierz.