Izolacja i hodowla pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy

Weźmy świeżo zebrany mózg szczeniaka myszy.

Oddziel móżdżek i usuń jego błoniastą warstwę.

Od strony brzusznej usuń sieć naczyń krwionośnych.

Pokrój móżdżek na fragmenty i przenieś je do probówki zawierającej bufor.

Odwirować i wyrzucić sklarowany osad zawierający zanieczyszczenia.

Dodaj trypsynę, enzym proteolityczny, aby strawić macierz zewnątrzkomórkową tkanki i rozluźnić komórki.

Dodać bufor zawierający inhibitor trypsyny i DNazę.

Inhibitor zatrzymuje aktywność trypsyny, podczas gdy DNaza degraduje wszelkie zanieczyszczające DNA.

Mechanicznie dysocjuj tkankę, tworząc zawiesinę komórkową, w tym neurony ziarniste móżdżku i komórki nieneuronalne lub glejowe.

Przenieść zawiesinę komórek do probówki.

Dodaj bufor. Odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce i poszczepić je na płytkach hodowlanych pokrytych poli-D-lizyną.

Komórki przyczepiają się do powlekanych powierzchni.

Dodaj antymetabolit, aby wyeliminować proliferujące komórki glejowe i wygenerować czystą kulturę neuronów ziarnistych móżdżku.

Aby wyizolować móżdżek, umieść mózg w roztworze preparacyjnym uzupełnionym siarczanem magnezu i trzymaj roztwór i mózg na lodzie.

Pod mikroskopem preparacyjnym usuń opony mózgowe za pomocą drobnych kleszczy. Następnie wypreparuj móżdżek z mózgu w roztworze preparacyjnym uzupełnionym siarczanem magnezu. Pomaga to w odklejaniu pozostałych opon mózgowych i pozwala przejść między warstwami w celu oczyszczenia fałdów móżdżku.

Obecność opon mózgowych w hodowli neuronów powoduje niezdrowe komórki i ostateczną śmierć komórki. W związku z tym ważne jest, aby zapewnić całkowite usunięcie opon mózgowych przed przystąpieniem do hodowli.

Następnie obróć móżdżek na jego brzuszną stronę i upewnij się, że usunięto splot naczyniówkowy. Następnie umieść móżdżek w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym 1 mililitr roztworu preparacyjnego uzupełnionego siarczanem magnezu. Pokrój tkanki na małe kawałki i przenieś je do 50-mililitrowej probówki zawierającej 30 mililitrów roztworu preparacyjnego buforowanego siarczanem magnezu.

Na tym etapie odwiruj 50-mililitrową probówkę zawierającą posiekaną tkankę mózgową przez pięć minut w temperaturze 644 razy g i 4 stopnie Celsjusza. Następnie usuń supernatant i dodaj 10 mililitrów roztworu do rozwarstwiania trypsyny. Następnie potrząsaj stołem na wysokich obrotach przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj 10 mililitrów roztworu inhibitora trypsyny-I do probówki i delikatnie kołysz przez dwie minuty. Następnie odwiruj probówkę przez pięć minut w temperaturze 644 razy g i 4 stopnie Celsjusza. Po pięciu minutach usuń supernatant i dodaj 2 mililitry roztworu inhibitora trypsyny-II przed przeniesieniem go do 15-mililitrowej probówki.

Następnie rozcieraj tkankę w 15-mililitrowej probówce, aż roztwór stanie się mętny. Pozwól mu osiąść na pięć minut. Następnie usunąć klarowny supernatant i przenieść go do nowej probówki zawierającej 1 mililitr roztworu preparacyjnego uzupełnionego chlorkiem wapnia.

Dodaj kolejne 2 mililitry roztworu inhibitora trypsyny-II na dno probówki zawierającej osad. Ponownie rozetrzyj go i pozwól mu osiąść przez pięć minut. Usunąć supernatant i dodać go do probówki zawierającej supernatant z poprzedniego etapu. Powtarzaj ten proces, aż większość tkanki zostanie mechanicznie zdysocjowana.

Dodać 0,3 mililitra roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego chlorkiem wapnia do zbioru sklarowanego nad osadem na każdy mililitr supernatantu. Wymieszać zawartość probówki, a następnie wirować przez pięć minut w temperaturze pokojowej 644 razy g. Następnie usuń supernatant. Dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki do granulki i wymieszaj.

Następnie policz żywe komórki i rozcieńcz je do stężenia 1,5 x 10⁶ komórek na mililitr. Umieść komórki na wcześniej przygotowanych płytkach z poli-D-lizyny. W przypadku płytek czterodołkowych umieść 0,5 mililitra próbki, co daje 7,5 x 10⁵ komórek na studzienkę. W przypadku naczyń 35-milimetrowych należy umieścić na płytce 4 mililitry próbki, co daje 6 x 10⁶ komórek na płytkę. W przypadku szkiełek nakrywkowych płytka 0,5 ml, co daje 7,5 x 10⁵ komórek na studzienkę.

Po 24 godzinach dodaj AraC do dwóch płytek, aby zmniejszyć zanieczyszczenie glejowe. Jeśli komórki mają być utrzymywane przez siedem do ośmiu dni, powtórz ten zabieg w dniu 3 i utrzymuj kultury w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 stopni Celsjusza.