Generowanie eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego i zdysocjowanej hodowli komórkowej

Zacznij od zwoju korzenia grzbietowego lub tkanek DRG w podłożu bez surowicy. Tkanka DRG zawiera neurony czuciowe i satelitarne komórki glejowe osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej, ECM.

Wysiewaj je na szalce hodowlanej pokrytej galaretowatą mieszanką białek, aby zwiększyć przyczepność tkanek.

Z biegiem czasu komórki glejowe uwalniają neurotroficzne czynniki wzrostu, które umożliwiają rozszerzenie neuronów, tworząc hodowlę eksplantatów DRG.

Aby rozwinąć zdysocjowaną hodowlę komórkową, weź te eksplantaty DRG w probówce. Potraktuj je kolagenazą, aby zdegradować ECM, a następnie trypsyną, która zakłóca połączenia komórkowe, uwalniając neurony i komórki glejowe.

Dodaj pożywkę wzbogaconą serum, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.

Kilkakrotnie pipetować zawartość, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową i przefiltrować ją w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Odwirować tę zawiesinę komórkową i usunąć supernatant zawierający enzym.

Ponownie zawiesić komórki w podłożu neurobazalnym i przenieść je na płytkę pokrytą lamininą.

Satelitarne komórki glejowe i neurony czuciowe przylegają do płytki pokrytej lamininą, tworząc zdysocjowaną hodowlę komórkową.

Przenieś każdy DRG na suchą, szklaną szalkę Petriego. Pod mikroskopem chirurgicznym oczyść i odetnij nadmiar włókien i tkanki łącznej nadal przyczepionych do DRG za pomocą ostrza. DRG jest łatwo rozpoznawalny jako wybrzuszona, przezroczysta struktura wzdłuż białego nerwu rdzeniowego, a naczynia krwionośne często znajdują się wokół DRG.

Następnie umieść oczyszczone z DRG na nowej szalce Petriego zawierającej lodowato zimne podłoże bez surowicy. Rozcieńczyć galaretowatą mieszaninę białek w lodowatym podłożu bez surowicy w stosunku 1 do 1. Następnie utrzyj DRG ex vivo na płytkach 12-dołkowych, wstępnie pokrytych 10 lub 20 mikrolitrami galaretowatej mieszanki białek i utrzymuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut.

Teraz delikatnie dodaj 1,5 do 2 mililitrów pożywki bez surowicy do systemu hodowlanego, aby pokryć cały eksplant i utrzymać eksplantaty w warunkach hodowli. Zmieniaj pożywkę DRG co 72 godziny. i pozwól DRG rosnąć tak długo, jak to konieczne.

Jest to krytyczny krok, ponieważ DRG jest zakotwiczony w szklanej płytce za pomocą galaretowatej mieszanki białek. Dlatego czas polimeryzacji i umiejętności pipetowania mają kluczowe znaczenie, aby uniknąć unoszenia się na wodzie.

W tej procedurze umieść cały zebrany DRG w sterylnej probówce o pojemności 1,5 mililitra z pożywką F12 zawierającą kolagenazę IV i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Następnie zastąp świeżą pożywkę zawierającą kolagenazę IV i inkubuj próbkę przez kolejne 45 minut. Następnie potraktuj eksplantaty 2 mililitrami pożywki F12 zawierającej 0,025% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Natychmiast po podaniu kolagenazy dożylnie inkubować je z 2 mililitrami pożywki F12 zawierającej płodową surowicę bydlęcą w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umyj eksplantaty trzykrotnie 2 mililitrami pożywki F12 i przystąp do mechanicznej dysocjacji za pomocą szklanej pipety, aż podłoże stanie się mętne.

Następnie przefiltruj zdysocjowaną kulturę komórkową przez filtr 0,22 mikrometra, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i nadmiar tkanki łącznej. Następnie odwiruj przefiltrowany lizat komórkowy przez dwie minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach pożywki neuro-podstawowej. Umieść zdysocjowane komórki na szkiełkach pokrytych lamininą w preferowanej gęstości komórek.