Izolowanie neuronów czuciowych i współhodowla z komórkami NK

Weźmy zwój korzenia grzbietowego lub DRG, skupisko neuronów czuciowych, w zimnym podłożu zawierającym surowicę, aby chronić neurony podczas późniejszego przetwarzania.

Odwirować, a następnie usunąć supernatant.

Dodać bufor fosforanowy zawierający enzymy trawienne i inkubować z łagodnym mieszaniem.

Enzymy dysocjują macierz zewnątrzkomórkową lub ECM i tkankę DRG, rozluźniając komórki.

Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby dezaktywować enzymy.

Odwirować, a następnie wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić DRG i mechanicznie zdysocjować tkankę za pomocą pipet o stopniowo zmniejszających się rozmiarach, aby uzyskać zawiesinę komórek.

Ułóż komórki na gradiencie gęstości albuminy surowicy bydlęcej.

wirówka. Neurony osiadają na dnie, tworząc osad.

Wyrzuć warstwy zawierające resztki tkanek.

Ponownie zawiesić neurony w pożywce hodowlanej.

Dodaj neurony do naczynia hodowlanego pokrytego ECM i inkubuj.

Usuń pożywkę i dodaj komórki NK lub NK.

Dodaj pożywkę do kohodowli i zbadaj interakcję między tymi komórkami.

Zbierz DRG do 15-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej 10 mililitrami lodowatego, uzupełnionego DMEM. Następnie odwirować preparat przez 5 minut w temperaturze 200 g w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodaj 250 mikrolitrów PBS zawierających 1 miligram na mililitr kolagenazy IV i 2,4 jednostki na mililitr Dispase. Inkubować ten DRG z roztworem kolagenazy przez 80 minut z łagodnym mieszaniem.

Aby dezaktywować enzymy, dodaj 5 mililitrów uzupełnionej pożywki DMEM i odwiruj roztwór przy 200 g. Po 5 minutach delikatnie usuń supernatant za pomocą pipety i pozostaw około 100 mikrolitrów supernatantu, aby uniknąć niepożądanej utraty komórek. Następnie dodaj 1 mililitr uzupełnionego DMEM do komórek i użyj pistoletu do pipet i trzech szklanych pipet Pasteura o malejących rozmiarach, aby delikatnie rozprowadzić DRG na preparat jednokomórkowy.

Za pomocą pipety P200 dodaj zawiesinę zwojów nerwowych zawierających neurony z boku rurki do gradientu BSA. Następnie ustaw przyspieszenie i opóźnienie na minimum, aby odwirować neuron zawierający gradient BSA przez 12 minut przy 200 g. Po odwirowaniu usuń cały supernatant za pomocą pipety i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach neurobasela.

Umieść 10 000 neuronów na dołku na 96-dołkowej płytce pokrytej lamininą z płaskim dnem. Aby umożliwić przyczepienie się neuronów, inkubuj 96-dołkową płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć kokulturę, powoli usuń neuronalę z hodowli neuronów i dodaj 10⁵ komórek NK na studzienkę do hodowli neuronów.