Badanie wpływu pestycydów na neurony Caenorhabditis elegans

Zacznij od płytki agarowej zawierającej transgeniczne Caenorhabditis elegans wykazujące ekspresję zielonych białek fluorescencyjnych lub GFP w swoich neuronach.

Dodaj sterylną wodę do płytki, zakręć nią, aby podnieść robaki i przenieś je do tubki.

Pozwól robakom się uspokoić, a następnie usuń nadmiar wody i ponownie je zamieszaj.

Przenieść zawieszone robaki na płytkę pokrytą pestycydem i płytkę kontrolną bez pestycydu, a następnie inkubować.

Na podstawie ich działania, pestycyd specyficznie uszkadza niektóre neurony i powoduje obrzęk neuronów, zmniejszając ekspresję GFP.

Przenieś robaki na podkładkę agarozową, która zawiera środek znieczulający, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe.

Zamontuj szkiełko na mikroskopie fluorescencyjnym. Najpierw wizualizuj robaki w trybie kontrastu fazowego, a następnie przełącz się na tryb fluorescencji.

U robaków poddanych działaniu pestycydów neurony wykazują zmniejszoną fluorescencję, obrzęk somy i przerwy w procesach neuronalnych, co wskazuje na skutki neurodegeneracyjne.

Podczas kontroli zdrowe neurony wykazują nienaruszoną somę z jasną fluorescencją.

Za pomocą mikropipety umieść 1 mililitr sterylnej wody na płytce nicieni. Następnie przetrząśnij wodą, aby podnieść nicienie. Następnie usuń płyn z nicieniami do 1,5-mililitrowej rurki do mikrofuge. Po 10 minutach, gdy nicienie osiadają grawitacyjnie, ostrożnie usuń co najmniej 500 mikrolitrów wody i wylej.

Następnie ponownie wymieszaj nicienie i za pomocą odciętej żółtej końcówki pipety usuń od 50 do 100 mikrolitrów zawieszonych robaków na każdą płytkę leczniczą, upewniając się, że na każdej płytce znajduje się co najmniej 10 dorosłych robaków. Przygotuj dwa szkiełka, umieszczając kawałek taśmy etykietowej tylko po jednej stronie szkiełka, aby utworzyć podkładkę o jednolitej grubości.

Następnie umieść czystą, nieużywaną zjeżdżalnię między nimi na blacie. Umieść 10-mikrolitrową kroplę stopionej agarozy na środku szkiełka za pomocą mikropipetora. Następnie spłaszcz kroplę, umieszczając kolejny czysty szkiełko na górze prostopadle do szkiełka ze spadkiem i dociśnij tak, aby kropla agarozy utworzyła grubość taśmy etykietowej.

Następnie zastosuj stały nacisk, aby rozdzielić dwie szkiełka. Następnie połóż szkiełko stroną agarową do góry na blacie i pozostaw do wyschnięcia na jedną do dwóch minut przed użyciem. Aby dodać nicienie do przygotowanego szkiełka z podkładką agarozową, dodaj do podkładki agarowej 5-mikrolitrową kroplę wody zawierającą 1 mol azydku sodu, która znieczuli robaki i zmobilizują je.

Następnie należy przenieść co najmniej 10 nicieni na szkiełko zabiegowe do kropelki za pomocą wykałaczki do robaków, którą należy wysterylizować przed i po przeniesieniu nicieni. Następnie dodaj szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy, umieszczając je pod kątem i powoli opuszczając.

Następnie umieść przygotowany mokry uchwyt na mikroskopie fluorescencyjnym, aby obserwować robaki, najpierw pod 10-krotnym powiększeniem i kontrastem fazowym, a następnie pod 40-krotnym powiększeniem z kontrastem fazowym i oświetleniem fluorescencyjnym.

Umieść jeden przygotowany mokry uchwyt na raz na stoliku mikroskopu i zabezpiecz go na miejscu za pomocą klipsów do stolika mikroskopu. Następnie zacznij oglądać mokre wierzchowce z obiektywem o najmniejszym powiększeniu, który zwykle wynosi 10x, i użyj jasnego pola lub kontrastu fazowego, aby zobaczyć i skupić się na nicieniach.

Gdy nicienie znajdą się w polu view, ustaw na nim ostrość za pomocą pokrętła precyzyjnej ostrości na mikroskopie. Następnie przełącz oświetlenie na fluorescencję, obracając pokrętło i skieruj światło na aparat, aby uchwycić obrazy cyfrowe.

Następnie dostosuj oświetlenie za pomocą oprogramowania do obrazowania, aby neurony były jasno oświetlone, ale nie przesycone. W pewnym momencie uzyskaj osobny obraz linijki w tym samym powiększeniu co obrazy komórek, aby zapewnić skalę powiększenia dla ich figury.