Wywoływanie penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu u dorosłych much Drosophila

Weźmy na przykład nowo powstałe, genetycznie zmodyfikowane dorosłe muchówki Drosophila.

Ciała grzybów w mózgu muchy zawierają neurony, które wyrażają zielone białka fluorescencyjne.

Ciała grzybów to struktury zawierające złożone sieci neuronowe niezbędne do uczenia się i zapamiętywania.

Znieczul muchy na podkładce z dwutlenkiem węgla.

Pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w wymagane filtry wizualizuj ciała grzybów wyrażające zieloną fluorescencję.

Weź odkażoną szpilkę Minutien i wepchnij ją przez kapsułkę na głowę do korpusu grzyba.

Powoduje to uszkodzenie neuronów ciała grzyba i zakłóca sieci neuronowe, powodując penetrujące urazowe uszkodzenie mózgu.

Następnie delikatnie wyjmij szpilkę z rozporka.

Umieść zranione muchy w fiolce z jedzeniem i pozwól im dojść do siebie w celu dalszych badań.

Po znieczuleniu much na podkładce z dwutlenkiem węgla, w ciągu sześciu godzin od eklacji należy posortować nowo zamknięte młode samce much F1 i umieścić je w czystych fiolkach zawierających pokarm z 40 lub mniej muchami na fiolkę. Następnie zdezynfekuj szpilki minutien, umieszczając około 100 szpilek w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej wypełnionej 70% etanolem na pięć minut. Następnie zdezynfekuj podkładkę z dwutlenkiem węgla w pędzlu, rozpylając 70% etanolu i wycierając do sucha czystą, niestrzępiącą się chusteczką.

Gdy narzędzia są czyste i suche, przenieś 40 lub mniej posortowanych samców F1 na czystą podkładkę i podziel je na dwie grupy. Jedna grupa posłuży jako nieuszkodzone muchy kontrolne, a druga grupa eksperymentalna zostanie poddana penetrującemu urazowemu uszkodzeniu mózgu. Następnie, za pomocą kleszczy, wyciągnij od czterech do pięciu nowych szpilek z probówki mikrowirówki i umieść je w pobliżu krawędzi podkładki z dwutlenkiem węgla. Następnie pod lunetą sekcyjną wybierz prostą szpilkę z ostrym końcem. Ponownie użyj ostrych szpilek i umieść uszkodzone lub szpilki w osobnej tubie zawierającej 70% etanolu w celu bezpiecznej utylizacji.

Następnie, dla muszek o standardowym genotypie krzyżowym, należy włączyć lampę LED stereomikroskopu wyposażoną w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji dla białka zielonej fluorescencji, co pozwala na wzbudzenie w odległości od 440 do 460 nanometrów i umożliwia wizualizację w odległości od 500 do 560 nanometrów. Następnie wybierz muchę z grupy eksperymentalnej i ustaw muchę tak, aby eksperymentator miał widok grzbietowy na kapsułę głowy z głową muchy po prawej stronie. Za pomocą kleszczy podnieś i przytrzymaj wybraną szpilkę do malowania w jednej ręce, a pędzel w drugiej. Następnie umieść szczoteczkę po wewnętrznej stronie grzbietowej klatki piersiowej i delikatnie dociśnij, aby ustabilizować muchę.

Wyceluj końcówką szpilki w korpusy grzybów, ciała komórek po prawej stronie głowy i przebij torebkę głowy. Jeśli używasz punktów orientacyjnych, celuj w naskórek głowy grzbietowej między oczkami a grzbietową krawędzią oka. Po zakończeniu urazu za pomocą pędzla delikatnie odepchnij główkę od kołka drobnicowego. Jeśli używasz mózgu do sekwencjonowania RNA lub qRT-PCR, wykonaj drugi uraz po lewej stronie głowy. Gdy wszystkie eksperymentalne muchy zostaną zranione, umieść kontrolne i zranione muchy w oddzielnych oznakowanych fiolkach zawierających pokarm.