Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Weźmy znieczuloną transgeniczną mysz z odsłoniętym zwojem korzenia grzbietowego lub DRG, skupiskiem komórek neuronów czuciowych, które otrzymują dane wejściowe z kończyn tylnych.

Neurony w DRG wyrażają cytoplazmatyczny wskaźnik wapnia.

Za pomocą mikroskopu konfokalnego zwizualizuj DRG, aby zobrazować zbiorową aktywność dużej liczby neuronów.

Bez stymulacji zewnętrznej, niski wewnątrzkomórkowy poziom wapnia utrzymuje wskaźniki w ich naturalnej konformacji, co powoduje słabą fluorescencję wyjściową.

Zastosuj bodziec mechaniczny lub termiczny do tylnej łapy, generując potencjał czynnościowy w neuronach czuciowych.

Sygnał rozchodzi się do DRG, gdzie bramkowane napięciem kanały wapniowe w neuronach otwierają się, umożliwiając napływ wapnia.

Dodatkowe jony wapnia wiążą się ze wskaźnikami, indukując zmianę konformacyjną, która zwiększa intensywność fluorescencji.

Obserwuj jasną fluorescencję w DRG, o intensywności odpowiadającej liczbie stymulowanych neuronów wykazujących napływ wapnia.

Umieść mysz na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza. Zlokalizuj powiększenie odcinka lędźwiowego, czując kość miednicy myszy. Następnie ogol grzbiet myszy powyżej obszaru powiększenia odcinka lędźwiowego. Za pomocą nożyczek wykonaj trójstronne prostokątne nacięcie nad powiększeniem odcinka lędźwiowego i odgiń skórę kleszczami.

Użyj 13-milimetrowych sprężynowych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać od 3 do 4 milimetrowych nacięć po prawej stronie kręgosłupa. Użyj nożyczek, aby odciąć skórę i mięśnie na boki, aby odsłonić kręgosłup. Następnie za pomocą 8-milimetrowych nożyczek odetnij mięsień i tkankę łączną, aby oczyścić wyrostek poprzeczny prawej strony L5 DRG.

Staraj się zminimalizować krwawienie, używając bawełnianej lub żelowej pianki do wchłaniania krwi. Rozetnij prawą stronę wyrostka poprzecznego L5 za pomocą rongeurów Friedmana-Pearsona lub mocnych cienkich kleszczy, uważając, aby nie dotknąć DRG. Następnie przesuń mysz i poduszkę grzewczą na niestandardową scenę. Użyj taśmy scenicznej, aby zabezpieczyć zwierzę i poduszkę grzewczą na miejscu.

Umieść nos zwierzęcia w stożku nosowym w celu ciągłego znieczulenia izofluranem. Zabezpiecz prawą tylną łapę wystającą do pozycji poza sceną, aby ułatwić aplikację bodźców. Zabezpiecz kręgosłup na miejscu za pomocą zacisków etapowych na skórze kręgów lub kości miednicy, tylko rostralnie i ogonowo do L5 DRG. Wyreguluj zaciski i stolik tak, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej równa.

Następnie umieść stolik pod mikroskopem tak, aby obiektyw znajdował się bezpośrednio 8 milimetrów nad DRG po opuszczeniu. Włóż termometr doodbytniczy. Podłącz przewody zasilające do poduszki grzewczej w termometrze doodbytniczym. Podłączyć stożek nosowy do przewodów gazowych izofluranu.

Użyj pionowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem DIC 10x/0,4 i odpowiednim oprogramowaniem do obrazowania. Użyj ustawień zielonego filtra FITC: wzbudzenie przy 495 nanometrach, emisja przy 519 nanometrach i długość fali wykrywania od 500 do 580 nanometrów. Pod mikroskopem znajdź powierzchnię DRG. Wyreguluj zaciski na stoliku tak, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej płaska, a maksymalna powierzchnia była wizualizowana w płaszczyźnie ogniskowej.

Monitorować zwierzę przez cały czas trwania zabiegu, aby utrzymać znieczulenie izofluranem bez przedawkowania. Aby załadować protokół szybkiego skanowania mikroskopu, użyj typowych ustawień rozmiaru woksela 2.496 na 2.496 na 16 mikronów, 512 na 512 pikseli, 10-optyczno-warstwowy z-stack, 1 jednostka Airy na 32 mikrometry, 1% moc lasera 488 nanometrów i 5 miliwatów, czas piksela - 1.52 mikrosekundy, czas linii - 0.91 milisekundy, czas klatki - 465 milisekund, prędkość skanowania LSM 8, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora PMD - 650 woltów i wzmocnienie cyfrowe 1.

Wykonaj krótkie, ośmiocyklowe skanowanie DRG, klikając przycisk Rozpocznij eksperyment w zakładce Akwizycja. Utwórz film, wykonując ortogonalną projekcję skanów przy jednym skanowaniu na klatkę w czasie. Ręcznie sprawdź klarowność obrazu i artefakty obrazu, takie jak fale jasności przechodzące przez DRG. Dostosuj pozycję zacisku i grubość przekroju optycznego, a następnie powtarzaj ten krok, aż do uzyskania wyraźnego filmu o wysokiej jakości.

Następnie załaduj protokół skanowania mikroskopu o wysokiej rozdzielczości przy użyciu typowych ustawień rozmiaru woksela 1,248 na 1,248 na 14 mikronów, 1024 na 1024 pikseli, sześciowarstwowy stos optyczny z, 1,2 jednostki Airy lub 39 mikrometrów, 5% moc lasera 488 nanometrów i 25 miliwatów, czas piksela - 2,06 mikrosekundy, czas linii - 4,95 milisekundy, czas klatki 5,06 sekundy, prędkość skanowania LSM 6, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora PMT przy 650 woltach i wzmocnienie cyfrowe 1.

Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment na karcie Akwizycja, aby utworzyć obraz DRG w wysokiej rozdzielczości. Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu i rejestruj spontaniczną aktywność w DRG przez 80 cykli. Wygeneruj film z projekcją ortogonalną i sprawdź, czy obraz jest wystarczającej jakości do analizy. Aby zastosować bodźce, ustaw mikroskop tak, aby wykonał od 15 do 20 skanów. Poczekaj na zakończenie skanowania od 1 do 5, aby utworzyć linię bazową. Zastosuj bodziec podczas skanów od 6 do 10. Odczekaj co najmniej pięć minut po każdym bodźcu przed zastosowaniem następnego, aby zapobiec odczulaniu.

W przypadku prasy mechanicznej przytrzymaj szczypce algometru łapą między łopatkami, nie dotykając łapy. Ściśnij łapę, zaczynając natychmiast po zakończeniu skanowania 5 i zatrzymując natychmiast po skanowaniu 10. Monitoruj siłę nacisku za pomocą algometru i upewnij się, że nie przekracza ona 10 g w stosunku do żądanej siły.

W przypadku bodźców termicznych podgrzej zlewkę z wodą do temperatury nieco powyżej żądanej. Gdy woda osiągnie odpowiednią temperaturę, zastosuj bodziec natychmiast po skanowaniu 5, zanurzając staw w wodzie. Odciągnąć zlewkę natychmiast po skanowaniu 10.