Obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila

Zacznij od zestawu mikroskopu konfokalnego zawierającego nieruchomą, genetycznie zmodyfikowaną nogę Drosophila zamontowaną w przestrzeni między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Aksony neuronu ruchowego w nodze wyrażają znakowane błoną białko fluorescencyjne

Użyj jednego lasera i dwóch detektorów, aby wychwycić sygnały fluorescencyjne z aksonów neuronów ruchowych i autofluorescencję tła naskórka, który jest najbardziej zewnętrzną warstwą nogi.

Dostosuj ustawienia obrazowania, aby uzyskać optymalną rozdzielczość i jakość obrazu.

Dostosuj jasność, aby zapewnić jasny sygnał aksonalny i nasyconą autofluorescencję naskórka.

Uchwyć obraz zarówno z sygnałem aksonalnym, jak i autofluorescencją naskórka.

Korzystając z odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, otwórz przechwycony obraz.

Podziel kanały i odejmij autofluorescencję naskórka tła od sygnału aksonalnego.

Dostosuj jasność i kontrast obu sygnałów, aby poprawić klarowność obrazu.

Połącz kanały, aby wygenerować scalony obraz w celu wizualizacji aksonów neuronów ruchowych w segmencie nogi.

Aby zobrazować nogi, użyj lasera o długości fali 488 nm i dwóch detektorów jednocześnie, aby ustawić pierwszą ścieżkę do uzyskania zarówno GFP, jak i autofluorescencji naskórka. Wybierz obiektyw zanurzający się w oleju od 20 do 25x i ustaw rozdzielczość na 1024 na 1024 piksele z 12-bitową głębią. I ustaw odstęp z na 1 mikrometr. Załaduj szkiełko na stolik mikroskopu.

Używając tej samej mocy lasera dla obu detektorów, dostosuj wzmocnienie pierwszego detektora, aby uzyskać jasny sygnał GFP. I dostosuj drugi detektor, aby upewnić się, że niektóre obszary o wysokim sygnale naskórka wytwarzają nasycony sygnał w tym detektorze. Następnie zobrazuj ramiona, używając opcji kafelka lub pozycji, aby uchwycić całe ramię, jeśli ramię jest wysunięte lub zbyt duże, aby można je było sobrazować w jednej klatce.

Aby przetworzyć obraz, otwórz stos konfokalny w ImageJ Fiji. I użyj wtyczki formats, aby otworzyć wszystkie obrazy, które nie są w formacie TIFF. Aby podzielić kanały, wybierz opcję Obraz, Kolor i Podziel kanały. Aby odjąć sygnał naskórka od sygnału GFP, otwórz Kalkulator procesów i obrazów i wybierz stos z detektora pierwszego jako Obraz1.

W oknie operacji wybierz Odejmij i wybierz ścieżkę z Detektora 2 jako Obraz2, tak aby został uzyskany tylko endogenny sygnał GFP. Użyj Image, Stacks, Z Protect, aby wygenerować projekcję maksymalnej intensywności dla endogennego sygnału GFP. Użyj elementów sterujących w oknie sterowania jasnością, aby dostosować jasność i kontrast.