Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania morfologii neuronów u szczeniaka myszy

Zacznij od ustawienia światła wzbudzającego dla mikroskopu dwufotonowego.

Weźmy znieczulone transgeniczne szczenię myszy z okrągłym szklanym okienkiem do obrazowania i płytką głowy wszczepioną w czaszkę.

Neurony wyrażają białka czerwonej fluorescencji, aby ułatwić obrazowanie.

Wyczyść szklane okienko do obrazowania i przymocuj szczenię do stolika obrazowania dwufotonowego.

Dopasuj okienko obrazowania do obiektywu mikroskopu, regulując głowę szczeniaka.

Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała szczeniaka.

Dostosuj natężenie przepływu środka znieczulającego.

Nałóż kroplę wody na szkiełko nakrywkowe, a następnie opuść soczewkę obiektywu mikroskopu.

Mikroskopia dwufotonowa wykorzystuje dwa fotony światła do aktywacji białek fluorescencyjnych, umożliwiając szczegółowe obrazowanie neuronów przy minimalnym szumie tła i fotowybielaniu.

Uchwyć obrazy neuronów na różnych głębokościach, aby zobrazować ich strukturę

Na koniec ułóż obrazy, aby wygenerować trójwymiarową reprezentację neuronu, w tym ich projekcje neuronalne, aby zbadać zmiany morfologiczne związane ze wzrostem.

Aby rozpocząć obrazowanie, najpierw ustaw dwufotonową długość fali lasera. Do wzbudzenia RFP użyj długości fali 1,000 nanometrów. Przetrzyj powierzchnię szkiełka nakrywkowego 70% etanolem. Przymocuj znieczulone szczenię do tytanowej płytki na stoliku do obrazowania za pomocą tytanowego pręta. Użyj stolika goniometru, aby wyregulować głowicę tak, aby szkiełko nakrywkowe było równoległe do soczewki obiektywu.

Utrzymuj temperaturę ciała szczeniaka podczas obrazowania, używając poduszki grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i zmniejsz stężenie izofluranu do 0,7% do 1%. Umieść stolik obrazowania pod soczewką obiektywu 20X mikroskopu dwufotonowego. Nałóż jedną kroplę wody na szkiełko nakrywkowe.

Ustaw oprogramowanie tak, aby pobierało obrazy stosu z w odstępach 1,4 mikrona. W przypadku obrazowania neuronów warstwy czwartej ustaw szerokość z w zakresie od 150 do 300 mikronów, aby zobrazować całą morfologię dendrytyczną. Użyj powolnego skanowania i uśredniania, aby uzyskać wyraźne obrazy pokazujące morfologię neuronów.

Uzyskanie całej morfologii dendrytycznej zajmuje zwykle więcej niż 20 minut.