Rozwarstwienie serca u larw, młodocianych i dorosłych danio pręgowanego, Danio rerio

Opisana jest przejrzysta, ustandaryzowana metoda preparowania i izolacji serca danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju. Omówiono również techniki adnotacji i kwantyfikacji.

Ogólnym celem tej procedury jest usunięcie serca z ryby danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie i naprawienie danio pręgowanego. Następnie otwierana jest jama ciała, aby uwidocznić serce.

Następnie serce jest usuwane i oczyszczane z tkanki niesercowej. Na koniec serce zostaje sfotografowane. Ostatecznie morfologię serca w czasie można zobaczyć za pomocą mikroskopii, przekrojów i fotografii.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie jako klucz do sekcji. Sta są trudne do nauczenia, ponieważ danio pręgowany jest mały, a tkanki nie różnią się kolorem i mogą być trudne do zidentyfikowania Aby wygenerować danio pręgowanego od larw przez dorosłe stadia. W tych eksperymentach wykonaj indywidualne krycia gruszek lub grupy z dorosłymi rybami.

Oczyść zarodki i przechowuj je w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po pięciu dniach od zapłodnienia oddziel ryby do zbiorników o gęstości od 10 do 15 ryb i umieść je w pomieszczeniu dla ryb. Wyjmij rybę ze zbiornika w odpowiednim wieku i umieść ją w 0,2% Trica w celu znieczulenia.

Umieść znieczuloną rybę w lodowatej wodzie na 15 minut w celu eutanazji. W międzyczasie dodaj 4% para formaldehydu lub PFA w jednym XPBS do naczynia. Inkubuj zebrane ryby w 4% PFA przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na szalce Petriego owiniętej w perfil.

Dzięki temu ryba jest płaska i znacznie ułatwia rozcięcie po utrwaleniu. Płukać dwukrotnie w PBS za pomocą 0,1%Tween lub PBT ryby można przechowywać w PBT w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 10 dni. Umieść pojedynczą rybę na szalce Petriego, wypełnionej do połowy świeżym PBS i połóż ją na prawym boku.

Zmierz długość ryby od pyska do podstawy ogona, nie uwzględniając płetw ogonowych, za pomocą cyfrowej suwmiarki milimetrowej. Jest to standardowa długość lub sl. Przypisz każdej rybie kombinację liter numerycznych, aby umożliwić śledzenie pojedynczej ryby i powstałego w ten sposób wypreparowanego serca w celu późniejszej analizy.

Wprowadź wszystkie dane, w tym wszystkie pomiary, do arkusza kalkulacyjnego i zorganizuj je na podstawie tych etykiet przed preparacją. Oznacz paski probówki PCR przypisanym numerem śledzenia i napełnij probówki PVT lub innym roztworem odpowiednim do dalszej analizy. Ustaw brzuszne miejsce ryby na szalce Petriego, stabilizując ciało za pomocą kleszczy, trzymając głowę między oczami i skrzelami w przypadku ryb o standardowej długości krótszej niż 12 milimetrów.

Za pomocą ostrych kleszczy lub mikroigły w uchwycie na szpilki. Usuń mięśnie piersiowe i płetwy z ciała, aby odsłonić serce. Ciągły ruch kleszczy podczas preparowania może powodować prądy w PPT, które poruszają rybą.

Jest to szczególnie problematyczne w przypadku mniejszych ryb. Dlatego należy użyć mikroigły, aby usunąć mięśnie piersiowe i płetwy oraz otworzyć jamę ciała. Użyj kleszczy, aby delikatnie zgarnąć serce z jamy spod przedsionka.

Jeśli ryba zawiera fluorescencyjny marker serca, użyj fluorescencyjnego oscyloskopu do sekcji i sprawdź, czy usunięto serce za pomocą fluorescencji. Po wyjęciu serca z jamy użyj kleszczy do przytrzymania serca i mikroigły, aby usunąć dodatkową tkankę niesercową i wyściółkę nasierdzia z zewnątrz serca. Dla ryb dłuższych niż 12 milimetrów w standardowej długości.

Za pomocą mikronożyczek ze sprężyną wykonaj trzy nacięcia. Najpierw wykonaj poprzeczne cięcie przez skrzela. Po drugie, wykonaj kolejne poprzeczne cięcie w przedniej części brzucha.

I po trzecie, wykonaj strzałkowe nacięcie po stronie brzusznej, łącząc oba poprzeczne cięcia. Za pomocą ostrych kleszczy usuń mięśnie piersiowe i płetwy z ciała, aby otworzyć jamę ciała i odsłonić srebrzystą tkankę osierdzia. Usuń tę tkankę osierdzia, a serce stanie się widoczne.

Użyj mikronożyczek, aby przeciąć tętnicę połączoną z tętnicą opuszkową znajdującą się nad sercem. Po przecięciu tej tętnicy umieść końcówki kleszczy pod przedsionkiem i użyj kleszczy, aby zgarnąć serce z jamy. Jeśli z sercem znajduje się dodatkowa tkanka, to w porządku, ponieważ można ją później usunąć.

Alternatywnie, u niektórych ryb, możliwe jest usunięcie serca poprzez delikatne wyciągnięcie bulwy, a reszta serca podąży za nim. Uważaj na lokalizację przedsionka, jeśli używasz alternatywnej techniki, ponieważ może on łatwo ulec uszkodzeniu. Jeśli z sercem znajduje się dodatkowa tkanka, jest to w porządku i można je później usunąć.

Po wyjęciu serca z jamy użyj dwóch kleszczy, aby przytrzymać serce i usunąć dodatkową tkankę lub jedną parę kleszczy do przytrzymania serca i mikroigłę, aby usunąć dodatkową tkankę niesercową. Aby sfotografować serce danio pręgowanego, przygotuj szalkę Petriego o wadze 23 gramów na litr składników odżywczych i przykryj zestalony agar PBS. Użyj kleszczy, aby zrobić zagłębienie w agare, które pozwoli sercu dopasować się we właściwej orientacji.

Wyjmij serce z probówki PCR, trzymając za końcówkę żarówki. Mocno kleszczami. Umieść serce w naczyniu agarowym.

Ustaw serce w agarze do sfotografowania. Próbka może być obracana po każdym zdjęciu do wszystkich możliwych orientacji. Użyj górnych, świetlnych i krótkich czasów naświetlania, aby sfotografować serca.

Dostosuj jakość światła, korzystając z ekspozycji, jeśli to konieczne, aby uzyskać najlepsze zdjęcie. Przykład dobrze wypreparowanego czystego serca pokazany jest tutaj. Każde serce będzie miało pewne różnice w ogólnej morfologii, ale serce powinno być kompletne z nienaruszonym przedsionkiem komory i bulwiastą tętnicą po jej rozwinięciu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem serca danio pręgowanego do zbadania dojrzewania serca na różnych etapach rozwoju danio pręgowanego.