Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Zabezpiecz znieczuloną mysz transgeniczną w stereotaktycznej ramie z odsłoniętą czaszką.

Ta mysz wykazuje ekspresję rekombinazy Cre w komórkach glejowych.

Umieść ramię stereotaktyczne trzymające rurkę kapilarną nad czaszką i ustaw je nad bregmą.

Dostosuj osie stereotaktyczne, aby uzyskać precyzyjne celowanie.

Wywierć otwór w miejscu docelowym, upewniając się, że opona twarda pozostaje nienaruszona. Usuń fragmenty kości.

Przepłukać rurkę kapilarną buforem. Przygotuj pęcherzyk powietrza, a następnie załaduj wirusa związanego z adenowirusem przenoszącym nieaktywne przeprogramowanie neuronów i geny białek fluorescencyjnych.

Opuść rurkę kapilarną na głębokość docelową i wstrzyknij roztwór wirusa do obszaru bogatego w komórki glejowe.

Ostrożnie schuj rurkę, aby zapobiec cofaniu się.

Zamknij nacięcie i pozwól na powrót do zdrowia.

Zinternalizowane wirusy dostarczają inaktywowane geny po bokach loxP do jądra glejowego. Rekombinaza Cre odwraca je, aktywując geny przeprogramowania neuronów i napędzając konwersję neuronalną. Przeprogramowane interneurony wyrażają białko fluorescencyjne pod promotorem specyficznym dla neuronu.

W celu wstrzyknięcia czynników przeprogramowujących należy umieścić znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej, na początku operacji podać odpowiednie środki przeciwbólowe, a następnie umieścić końcówkę szklanej kapilary igły iniekcyjnej tuż nad bregmą. Upewnij się, że końcówka kapilary jest idealnie prosta zarówno w płaszczyznach AP, jak i ML. Zresetuj wartości ML i A-P do 0,0 na cyfrowym liczniku współrzędnych.

Aby upewnić się, że głowa zwierzęcia znajduje się w idealnie płaskiej pozycji, użyj cyfrowego licznika współrzędnych do pomiaru wartości współrzędnych D-V, gdy ramię AP znajduje się na plus 2.0 i minus 2.0, a także gdy ramię ML znajduje się na plus 2.0 i minus 2.0. Dostosuj odpowiednio wysokość listwy zębatej i nauszników. Następnie należy lekko podnieść strzykawkę i wywiercić otwór za pomocą wiertła dentystycznego we współrzędnych wstrzyknięcia.

Rozpocznij wiercenie na miejscu, pracując w sposób okrężny i delikatny. Następnie umieść kawałek bawełnianej gazy na otwartym nacięciu i przepłucz strzykawkę roztworem soli fizjologicznej. Po przepłukaniu należy pobrać pęcherzyk powietrza, a następnie 1 mikrolitr roztworu zawierającego wektor wirusowy. Upewnij się, że roztwór wirusowy można łatwo zwizualizować poniżej pęcherzyka powietrza.

Następnie opuść strzykawkę, powoli przesuwając się na żądaną głębokość i upewnij się, że trajektoria jest wolna od fragmentów kości. Następnie wstrzyknij 1 mikrolitr roztworu wirusowego z szybkością 0,4 mikrolitra na minutę. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy odczekać dwie minuty do dyfuzji przed pobraniem strzykawki.

Po dyfuzji powoli wycofaj strzykawkę, aż końcówka naczynia włosowatego zostanie całkowicie usunięta z mózgu. Następnie ostrożnie zszyj nacięcie i wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej. Monitorować zwierzę na stacji pooperacyjnej do czasu odzyskania przytomności.

Zwierzęta są trzymane do 12 tygodni po wstrzyknięciu wirusa, aby umożliwić miejscowemu glejowi przeprogramowanie się w dojrzałe neurony.