In vivo (in vivo) Elektroporacja Morpholinos do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest zahamowanie lub obniżenie ekspresji określonego białka w siatkówce dorosłego danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez usunięcie najpierw zewnętrznej rogówki rybiego oka. Następnie w wewnętrznej rogówce oka powstaje mały otwór.

Następnie specyficzny dla genu morpho jest wstrzykiwany do ciała szklistego. Na koniec morfo jest elektroporowane do komórek siatkówki. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na zmniejszoną ekspresję białka docelowego za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej skrawków tkanki siatkówki lub immunoblottingu.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki. Ze względu na potencjał do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw proliferacji komórek glejowych Muellera w uszkodzonej siatkówce, możemy znaleźć sposoby na wywołanie podobnej reakcji w uszkodzeniu ludzkiej siatkówki. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regeneracji siatkówki w siatkówce dorosłego danio pręgowanego, może być nieznacznie zmodyfikowana, aby dostarczyć informacji o innych procesach zachodzących w siatkówce, takich jak rola określonych białek w transdukcji zdjęć lub przetwarzaniu wzrokowym.

Demonstracja procedury, która została opracowana przez dr Ryana Tummela, gdy był postdocem. W moim laboratorium będzie dr Travis Bailey, obecnie adiunkt w moim laboratorium. Przed rozpoczęciem pracy z rybami przygotuj dodatnio naładowane morfy znakowane lizaminą, które można elektroporować do komórek, rozcieńczając 300 NMO Morpho w 100 mikrolitrach turkusu wodnego wolnego od nukleaz do trzech milimolowych roztworów.

Aby usunąć zewnętrzną warstwę rogówki, znieczulij sześcio-12-miesięcznego danio pręgowanego w jednym miligramie na mililitr trica lub dwóch feth etanolu w zbiorniku danio pręgowanego owinąć danio pręgowanego w zwilżony kawałek ręcznika papierowego zakrywającego skrzela, ale pozostawiając oko odsłonięte. Umieść zawiniętą rybę pod stereoskopem i zwiększaj powiększenie, aż średnica oka wypełni około jednej trzeciej pola widzenia. Następnie, za pomocą pęsety numer pięć Dumonta, chwyć zewnętrzną rogówkę w pobliżu szczeliny wzrokowej w miejscu lekkiego występu lub wargi, aby zapobiec przemieszczeniu oka.

Podczas wyjmowania rogówki umocuj ją innym zestawem pęsety. Następnie pociągnij pod małym kątem w poprzek oka, aby usunąć rogówkę. Natychmiast po usunięciu zewnętrznej rogówki użyj skalpela z szafirowym ostrzem, aby wykonać małe nacięcie w rogówce, w miejscu, w którym źrenica styka się z obciążeniem tęczówki.

Wsyp pięć mikrolitrów roztworu morpho do strzykawki Hamiltona wyposażonej w wyjmowaną igłę z końcem o rozmiarze 33. Ruruj go w górę iw dół, aby usunąć powietrze z linii. Ostrożnie wprowadzić igłę do ciała szklistego przez nacięcie.

Nie należy wkładać igły zbyt głęboko, aby uniknąć przebicia siatkówki lub przemieszczenia soczewki. Powoli wstrzyknąć roztwór morpho do przestrzeni witriolu. Bezbarwne ciało szkliste wycieknie z nacięcia, gdy zostanie przemieszczone przez roztwór morpho.

Wstrzykiwać do momentu, aż niewielka ilość morpho wycieknie z nacięcia. Morino oznaczone lisaminą powinno być wyraźnie widoczne wewnątrz oka. Po wstrzyknięciu włóż rybę z powrotem do zbiornika, aby wyzdrowiała, używając drugiego oka jako kontroli z wstrzyknięciem unin, ustaw parametry elektroporacji na dwa kolejne impulsy 50 milisekund przy napięciu 75 woltów.

Z jednosekundową przerwą między impulsami po wstrzyknięciu około 10 ryb. Ponownie znieczulij rybę, której wstrzyknięto i zawiń ją w zwilżony kawałek papieru. Ręcznik tylko zakrywa skrzela, ale pozostawia odsłonięte oko.

Przenieś rybę na szalkę Petriego wypełnioną znieczuleniem. Rękami w rękawiczkach delikatnie przytrzymaj rybę na dnie naczynia wypełnionego znieczuleniem, uważając, aby całkowicie zanurzyć oko. Aby celować w siatkówkę grzbietową, delikatnie naciśnij elektrodę dodatnią w dół na brzusznej połowie oka, powodując obrót oka i odsłonięcie grzbietowej części gałki ocznej, jednocześnie naciskając po stronie brzusznej, umieść elektrodę ujemną w odległości od 0,5 do jednego milimetra od odsłoniętej grzbietowej połowy oka.

Unikaj umieszczania elektrody ujemnej bezpośrednio na oku, ponieważ spowoduje to uszkodzenie siatkówki grzbietowej. Po ustaleniu odpowiedniej odległości między elektrodami należy wyregulować na uchwycie elektrod, aby utrzymać stały rozrzut do późniejszej elektroporacji. Naelektryzowano oko i zwrócono rybę do zbiornika ze słodką wodą w zbiorniku, aby natychmiast ożywić się poddać rybę procedurze, która powoduje zmiany w ekspresji genów siatkówki, takie jak zwyrodnienie siatkówki wywołane ciągłym światłem.

Kiedy siatkówki są przecięte od nosa do skroniowego na grzbietowej osi brzusznej, zacienione niebieskie pola reprezentują obszary siatkówki, które są najczęściej uszkodzone w wyniku samego zdarzenia elektroporacji. Zacienione różowe pole reprezentuje obszar, który jest przeznaczony do wprowadzenia morfo do komórek siatkówki przez elektroporację. Jak pokazano na obrazie po prawej stronie trzy dni po elektroporacji, znacznik lizaminy jest nadal wizualizowany we wszystkich warstwach i typach komórek w przekrojonej siatkówce, w tym w zewnętrznych segmentach pręcika, zewnętrznej warstwie jądrowej, warstwie międzyprzezroczystej i warstwie komórek zwojowych.

Pusty obraz po lewej stronie pochodzi z oka, w które wstrzyknięto uninę, bez lissaminy oznaczonej morino, pełne knockdown białka można osiągnąć w ciągu trzech do pięciu dni po elektroporacji, w zależności od skuteczności morpho. W tym przykładzie morfo kontroli ujemnej lub morfo A-P-C-N-A zostało elektroporowane do siatkówki, a siatkówki usunięto po jednej, dwóch lub trzech dniach ekspozycji na światło, a następnie tkankę przetworzono i wybarwiono immunologicznie przeciwciałami anty PCNA. Wiele komórek PCNA dodatnich na zielono zaobserwowano we wszystkich trzech kontrolnych siatkówkach, ale ekspresja PCNA była znacznie zmniejszona w siatkówkach morfiny.

Gdy już opanujesz tę technikę, powinieneś być w stanie wykonać zabieg na około 20 rybach w ciągu jednej godziny. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie dotykać elektrod bezpośrednio do oka ryby po tej procedurze. Inne metody, takie jak immunohistochemia, situ do hybrydyzacji, real time PCR i immuno blotting, można wykorzystać do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie szlaki genetyczne są wymagane w regeneracji siatkówki.