Name: Przygotowanie rusztowań fibrynowych 3D do zastosowań w hodowlach komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Naucz się przygotowywać trójwymiarowe rusztowania fibrynowe do hodowli i różnicowania komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia badanie zachowań komórek w mikrośrodowisku 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie w ramach grantu NSERC Discovery Grant 402462 „Tissue engineered scaffolds for controlling induced pluripotent stem cell behavior”.

Uwagi przed rozpoczęciem protokołu: Fibrynogen jest białkiem pochodzenia krwi, dlatego przed pracą z nim należy przejść odpowiednie szkolenie z zakresu bezpieczeństwa. Realizacja tego protokołu trwa 2 dni, więc należy odpowiednio zaplanować hodowle komórek macierzystych, aby były one gotowe do wysiewu. W celu obliczenia ilości odważonego fibrynogenu: trzy szalki Petriego o średnicy 35 mm z buforem TBS (TBS, pH 7.4) zawierające 110-130 mg fibrynogenu rozpuszczonego w 3 mL TBS będą wystarczające do przygotowania jednej płytki 24-dołkowej zawierającej 400 μl rusztowań fibrynowych w każdym dołku.
1. Dzień pierwszy: Przygotowanie roztworów fibrynogenu i dializa nocna
<ol>
	<li>Wyjąć liofilizowany fibrynogen z lodówki i pozostawić go na 20 minut, aby osiągnął temperaturę pokojową.</li>
	<li>Dodać 3 mL soli buforowej Tris (TBS) do każdej szalki Petriego o średnicy 35 mm. Każda porcja fibrynogenu daje od 2 do 3 mL roztworu fibrynogenu o stężeniu od 12 do 20 mg/mL; całkowitą ilość potrzebnego fibrynogenu można obliczyć na podstawie tych przybliżeń.</li>
	<li>Odważyć około 100-130 mg fibrynogenu (Fg) i rozsypać go na powierzchni TBS w każdej szalce. Odczekać 5 minut, aż fibrynogen zacznie przechodzić do roztworu. Przykryć szalkę Petriego pokrywką.</li>
	<li>Inkubować szalki Petriego w temperaturze 37°C przez 2 godziny, aby fibrynogen w pełni rozpuścił się w roztworze TBS.</li>
	<li>Zwilżyć membranę dializacyjną (cut-off 7000 MW) za pomocą TBS. Zagiąć dolny koniec membrany i zamknąć go za pomocą zacisku dializacyjnego.</li>
	<li>Przenieść roztwory fibrynogenu z szalek do membrany dializacyjnej za pomocą pipety. Zagiąć górny koniec i zamknąć go zaciskiem dializacyjnym.</li>
	<li>Umieścić membranę dializacyjną zawierającą roztwór fibrynogenu w 4-litrowym pojemniku z TBS. Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego ustawionego na niską prędkość (100 rpm).</li>
	<li>Prowadzić dializę roztworu przez noc na mieszadle magnetycznym przez co najmniej 12 godzin. Roztwór TBS nie wymaga wymiany w tym okresie.</li>
</ol>
2. Dzień 2: Polimeryzacja rusztowań fibrynowych i zasiew komórek macierzystych w rusztowaniach
Wszystkie etapy opisane dla tego procesu powinny być przeprowadzane w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, ponieważ rusztowania te będą zasiewane kulturami komórek macierzystych.
<ol>
	<li>Przenieść roztwóry fibrinogenu z tuby dializacyjnej do odpowiedniej wielkości probówki stożkowej (15 mL lub 50 mL).</li>
	<li>Przefiltrować roztwór fibrinogenu za pomocą filtra strzykawkowego 5,0 μm w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń. W zależności od objętości roztworu może być konieczne użycie kilku filtrów w celu przetworzenia całej objętości.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór fibrinogenu sterylnie za pomocą filtra 0,22 μm do probówki stożkowej 50 mL. Za pomocą odpowiednio dobranej pipety oznaczyć objętość przefiltrowanego roztworu fibrinogenu, która zostanie wykorzystana w późniejszych obliczeniach. W zależności od objętości roztworu może być konieczne użycie kilku filtrów w celu przetworzenia całej objętości.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję roztworu fibrinogenu przy 280 nm za pomocą spektrofotometru. Często konieczne jest zastosowanie czynnika rozcieńczenia 50, aby uzyskać absorbancję poniżej 1.</li>
	<li>Obliczyć stężenie białka w roztworze fibrinogenu, korzystając z następującego równania: [Fibrinogen w mg/mL] = (A280 × czynnik rozcieńczenia) ÷ 1,55, gdzie 1,55 to współczynnik ekstynkcji przy A280 dla ludzkiego fibrinogenu 13. Następnie, na podstawie objętości początkowej, obliczyć ilość buforu TBS potrzebną do rozcieńczenia roztworu do stężenia 11,1 mg/mL fibrinogenu. Końcowe stężenie białka w rusztowaniach fibrynowych po polimeryzacji wyniesie 10 mg/mL.</li>
	<li>Przygotować sterylne roztwory trombiny i chlorku wapnia. Najpierw dodać 15 μL roztworu trombiny (stężenie: 40 U/mL – stężenie końcowe w rusztowaniu wyniesie 2 U/mL) do prawej strony każdego dołka w pierwszym rzędzie płytki 24-dołkowej. Następnie dodać 15 μL 50 mM roztworu chlorku wapnia do lewej strony każdego dołka. Na koniec dodać 270 μL roztworu fibrinogenu do płytki. Potrząsnąć płytką z boku na bok, a następnie z przodu na tył, aby zapewnić wymieszanie roztworów.</li>
	<li>Pozostawić rząd zawierający mieszaniny do polimeryzacji na 5 minut w temperaturze pokojowej. Rusztowania stają się bardziej nieprzezroczyste w miarę polimeryzacji.</li>
	<li>Powtarzać kroki 2.6 i 2.7 aż do momentu spolimeryzowania pożądanej liczby rusztowań fibrynowych.</li>
	<li>Po ostatniej 5-minutowej inkubacji umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C, aby umożliwić pełną polimeryzację rusztowań.</li>
	<li>Po zakończeniu jednej godziny inkubacji kolejnym krokiem jest zasiewanie rusztowania ciałami embrioidalnymi. Za pomocą pipety 20 μL wybrać pojedyncze ciało embrioidalne i umieścić je w centrum rusztowania fibrynowego. Sprawdzić pod mikroskopem, czy każdy dołek zawiera pojedyncze ciało embrioidalne.</li>
	<li>Dodać 5 μL roztworu trombiny (stężenie: 40 U/mL) i 5 μL 50 mM roztworu chlorku wapnia na każde ciało embrioidalne, a następnie 90 μL roztworu fibrinogenu do każdego dołka. Roztwór powinien utworzyć pęcherzyk enkapsulujący ciała embrioidalne.</li>
	<li>Umieścić płytkę ponownie w inkubatorze w temperaturze 37°C na dodatkową godzinę, aby zapewnić polimeryzację.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 1 mL odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej do każdego dołka i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia schemat widoku z boku pojedynczego dołka zawierającego 3D-system hodowli na rusztowaniu fibrynowym z zaszczepionym ciałem embrionoidalnym. Rysunek 2A prezentuje reprezentatywne obrazy mysich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na warstwach karmnych z mysich embrionalnych fibroblastów. Komórki te są następnie indukowane do tworzenia ciał embrionoidalnych, czyli agregatów komórek zawierających progenitorów neuronalnych, przy użyciu 8-dniowego protokołu traktowania kwasem retinowym (Rysunek 2B) zgodnie z wcześniejszym opisem 14, natomiast Rysunek 3 pokazuje wygląd pochodzącego z iPS ciała embrionoidalnego po 3 dniach hodowli wewnątrz 3D-rusztowań fibrynowych. Podobne wyniki uzyskano wcześniej z zastosowaniem mysich embrionalnych komórek macierzystych 7. Dodatkowo, metoda ta była wykorzystywana do hodowli pochodzących z iPS ciał embrionoidalnych wytworzonych według innego protokołu z użyciem kwasu retinowego i purmorfaminy 15 wewnątrz 3D-rusztowań fibrynowych, co demonstruje wszechstronność tego systemu hodowlanego.
<img alt="Widok z boku schematu dołka hodowli komórkowej, warstwy fibryny, ciało embrionoidalne, pożywka komórkowa, inżynieria tkankowa." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Schemat przedstawiający widok z boku pojedynczego dołka zawierającego trójwymiarowe rusztowanie fibrynowe z zasianym ciałem embrionoidalnym.
<img alt="Porównanie morfologii komórek, obraz mikroskopowy; panele A i B pokazują różnice w strukturze komórkowej." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. Hodowla i różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) myszy. Aby zróżnicować te komórki w fenotypy neuronalne, komórki iPS hoduje się w zawiesinie w celu wytworzenia agregatów komórkowych zwanych ciałami embrionalnymi (EB). Następnie EB są traktowane kwasem retinowym w celu indukcji różnicowania neuronalnego; protokół ten był wcześniej stosowany do indukcji różnicowania neuronalnego w embrionalnych komórkach macierzystych. A) Niedróżnicowana kolonia mysich komórek iPS hodowana na warstwie karmidła z embrionalnych fibroblastów mysich. B) Ciała embrionalne pochodzące z mysich komórek iPS w hodowli w zawiesinie, pobrane w 8. dniu po traktowaniu kwasem retinowym w celu indukcji różnicowania neuronalnego. Pasek skali wynosi 100 μm.
<img alt="Obraz mikroskopowy struktury komórkowej, kolonii komórek macierzystych, różnicowania komórkowego, analizy badawczej." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. Przykładowe wyniki dla ciała embrionalnego iPS myszy po 3 dniach hodowli wewnątrz trójwymiarowego rusztowania fibrynowego. Komórki zaczęły migrować i różnicować się wewnątrz rusztowania fibrynowego. Pasek skali wynosi 500 μm.

<ol><li>Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+and+dynamics+of+natural+and+engineered+stem+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Syst.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).</li>
<li>Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillerth%2C+SM+%22StemBook%22">StemBook</a>. , (2008).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin%3A+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).</li>
<li>Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+a+delivery+system+for+therapeutic+drugs+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).</li>
<li>Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+soluble+growth+factors+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+of+fibrin+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds.</a> Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).</li>
<li>Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fibrin+scaffolds+for+differentiation+of+murine+embryonic+stem+cells+into+neural+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells.</a> Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).</li>
<li>Gorodetsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+Microbeads+Loaded+with+Mesenchymal+Cells+Support+Their+Long-Term+Survival+While+Sealed+at+Room+Temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature.</a> Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).</li>
<li>Barsotti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+acts+as+biomimetic+niche+inducing+both+differentiation+and+stem+cell+marker+expression+of+early+human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells.</a> Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).</li>
<li>Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin+constructs+evaluated+in+vitro+and+in+nude+mouse+and+rabbit+defects+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models.</a> Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).</li>
<li>Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+fibrinogen+and+thrombin+concentrations+promote+neuronal+rather+than+glial+growth+when+primary+neural+cells+are+seeded+within+plasma-derived+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).</li>
<li>Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+for+expansion+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).</li>
<li>Dellenback, R. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extinction+coefficient+of+fibrinogen+from+man%2C+dog%2C+elephant%2C+sheep%2C+and+goat+at+280+mmu%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+ventral+spinal+progenitors+and+motor+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules.</a> Stem Cells. 26, 886-893 (2008).</li>
<li>Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+aprotinin+for+improved+stability+of+fibrin+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials.</a> Biomaterials. 32, 430-438 (2011).</li>
<li>Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+controlled+growth+factor+delivery+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+fibrin+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds.</a> Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).</li>
<li>Chen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+improvement+of+focal+cerebral+ischemia+injury+by+subdural+transplantation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+fibrin+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue.</a> Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Opisany powyżej protokół przedstawia metodę generowania trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, a w szczególności mysich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten system hodowli oparty na biomaterialach 3D dokładniej naśladuje niszę komórek macierzystych występującą in vivo, w związku z czym może być wykorzystany do przesiewania sygnałów biologicznych w celu określenia ich wpływu na różnicowanie komórek macierzystych 6<...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Wymagany sprzęt:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Waga analityczna&lt;br/&gt;pH-metr&lt;br/&gt;Inkubator do hodowli tkankowych (37&amp;#x00B0;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;br/&gt;Mieszadło magnetyczne&lt;br/&gt;Spektrofotometr&lt;br/&gt;Sterylna komora z laminarnym przepływem powietrza</td></tr><tr><td colspan="4">Roztwór soli buforowanej Tris (pH 7.4) (wymagane 4 L oraz ilość wystarczająca do rozpuszczenia fibrynogenu)&lt;br/&gt;50 mM roztwór chlorku wapnia&lt;br/&gt;Sterylne probówki stożkowe (15 lub 50 mL) &lt;br/&gt; Szalki Petriego 35 mm&lt;br/&gt;Membrana do dializy (granica odcięcia 7,000 MW)&lt;br/&gt;Klamry do dializy&lt;br/&gt;Filtry strzykawkowe 5.0 &amp;#x03BC;m&lt;br/&gt;Indywidualnie pakowane sterylne filtry strzykawkowe 0.22 &amp;#x03BC;m&lt;br/&gt;Strzykawka&lt;br/&gt;24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Fibrynogen (ludzki)</td><td>Calbiochem</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>Trombina (ludzka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Komórki macierzyste występują w naturalnie tworzących się trójwymiarowych mikrośrodowiskach in vivo, które często określa się mianem niszy komórek macierzystych 1. Hodowla komórek macierzystych wewnątrz trójwymiarowych rusztowań z biomateriałów pozwala na dokładne naśladowanie tych mikrośrodowisk, co stanowi przewagę nad tradycyjnymi metodami hodowli 2D z wykorzystaniem polistyrenu, a także jest metodą inżynierii tkanek zastępczych 2. Choć w większości eksperymentów z hodowlami komórkowymi stosowano polistyren do hodowli tkankowej 2D, rusztowania z biomateriałów 3D mogą dokładniej odwzorowywać mikrośrodowiska występujące in vivo, umożliwiając precyzyjniejsze ustalenie polaryzacji komórek w środowisku oraz posiadając właściwości biochemiczne i mechaniczne zbliżone do tkanek miękkich.3 Jako środowiska 3D wspierające wzrost komórek macierzystych badano różnorodne rusztowania z biomateriałów pochodzenia naturalnego i syntetycznego. Podczas gdy rusztowania syntetyczne mogą być projektowane tak, aby posiadały szerszy zakres właściwości mechanicznych i chemicznych i często charakteryzują się większą powtarzalnością, biomateriały naturalne składają się często z białek i polisacharydów występujących w macierzy zewnątrzkomórkowej, w związku z czym zawierają miejsca wiązania dla adhezji komórek i łatwo wspierają hodowlę komórkową. Rusztowania fibrynowe, otrzymywane poprzez polimeryzację białka fibrynogenu pozyskanego z osocza, były szeroko badane w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej zarówno in vitro, jak i in vivo 4. Takie rusztowania mogą być modyfikowane za pomocą różnych metod w celu wbudowania systemów kontrolowanego uwalniania czynników terapeutycznych 5. Wcześniejsze prace wykazały, że takie rusztowania można z sukcesem wykorzystać do hodowli embrionalnych komórek macierzystych, a ten system hodowli oparty na rusztowaniach może służyć do badania wpływu różnych czynników wzrostu na różnicowanie zasianych wewnątrz nich komórek macierzystych 6,7.
 Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces polimeryzacji rusztowań fibrynowych z roztworów fibrynogenu z wykorzystaniem aktywności enzymatycznej trombiny. Cały proces trwa 2 dni, wliczając w to nocny etap dializy roztworu fibrynogenu w celu usunięcia cytratów hamujących polimeryzację. Opisane metody opierają się na stężeniach fibrynogenu określonych jako optymalne dla hodowli komórek embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Inne grupy badawcze prowadziły dalsze analizy rusztowań fibrynowych dla szerokiej gamy typów komórek i zastosowań, wykazując wszechstronność tego podejścia 8-12.

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Komórki macierzyste występują in vivo w naturalnie tworzących się trójwymiarowych mikrośrodowiskach, które często określa się mianem niszy komórek macierzystych 1. Hodowla komórek macierzystych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym embrionalnych oraz indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie roztworów fibrynogenu i ich dializę przez noc w celu usunięcia cząsteczek hamujących polimeryzację. Drugim krokiem procedury jest polimeryzacja dolnej warstwy bazowej fibryny w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej.Trzecim krokiem procedury jest wysiewanie. Pojedynczy korpus embrionalny pochodzący z pluripotencjalnych komórek macierzystych nanosi się na warstwę podstawową rusztowania, a następnie dodaje drugą warstwę fibryny, aby dokonać pełnej enkapsulacji. Ostatnim krokiem procedury jest dodanie do rusztowań odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej.W zależności od zastosowania, ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, że ciała embrionalne pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być skutecznie hodowane wewnątrz trójwymiarowych rusztowań z fibryny, opartych na biomateriałach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli komórkowej 2D jest moż

preparation-of-3d-fibrin-scaffolds-for-stem-cell-culture-applications

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przygotowanie 3D szkieletów fibryny do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Naucz się przygotowywać trójwymiarowe rusztowania fibrynowe do hodowli i różnicowania komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia badanie zachowań komórek w mikrośrodowisku 3D.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów