Przygotowanie rusztowań fibrynowych 3D do zastosowań w hodowlach komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie rusztowań 3D fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie roztworów fibrynogenu i dializowanie ich przez noc w celu usunięcia cząsteczek hamujących polimeryzację. Drugim etapem procedury jest polimeryzacja dolnej warstwy bazowej fibryny w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Trzecim krokiem procedury jest wysiew. Pojedynczy korpus zarodka jest pozyskiwany z pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawową warstwę rusztowania, a następnie dodawana jest druga warstwa fibryny w celu całkowitej enkapsulacji. Ostatnim etapem zabiegu jest dodanie odpowiednich pożywek do hodowli komórkowych do rusztowań.

W zależności od zastosowania, ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że ciała zarodkowe pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być z powodzeniem hodowane w 3D fibrynie, rusztowaniach na bazie biomateriału. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli komórkowych 2D jest to, że można obserwować i manipulować zachowaniem komórek macierzystych w trzech wymiarach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biologii komórek macierzystych poprzez badanie przesiewowe czynników, takich jak związki chemiczne i czynniki wzrostu, które wpływają na zachowanie komórek macierzystych W mikrośrodowisku 3D fibrynogen jest białkiem pochodzącym z krwi, dlatego przed użyciem należy ukończyć odpowiednie szkolenie w zakresie bezpieczeństwa.

Na początek wyjmij liofilizowany fibrynogen z lodówki i pozostaw go na 20 minut, aby osiągnął temperaturę pokojową, dodaj trzy mililitry soli fizjologicznej buforowanej tris do każdej 35-milimetrowej szalki Petriego. Odważ około 100 do 130 miligramów fibrynogenu i rozsyp go na powierzchni TBS w każdym naczyniu. Odczekaj pięć minut, aż fibrynogen zacznie przechodzić do roztworu.

Następnie przykryj szalkę Petriego pokrywką. Inkubować szalki Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby fibrynogen mógł w pełni przejść do roztworu. Następnie mokry przewód do dializy z TBS Złóż dolny koniec rurki i zaciśnij koniec za pomocą zacisków do dializy, a następnie pipetuj roztwór fibrynogenu z naczyń do rurki do dializy.

Następnie złóż górny koniec i zamknij zacisk za pomocą zacisku do dializy. Umieścić rurkę dializacyjną zawierającą roztwór fibrynogenu w czterolitrowym pojemniku TBS. Wymieszać roztwór.

Używając płytki mieszającej ustawionej na niską prędkość, dializuj roztwór przez noc na płytce przez co najmniej 12 godzin. W tym czasie roztwór T Bs nie musi być zmieniany pod sterylnym kapturem do hodowli tkankowych. Usunąć roztwór fibrynogenu z rurki dializacyjnej i umieścić go w stożkowej rurce.

Przefiltruj roztwór fibrynogenu za pomocą pięciomikronowego filtra strzykawkowego, aby usunąć duże zanieczyszczenia z roztworu. Następnie użyj filtra punktowego 22 mikronów do przefiltrowania, wysterylizuj roztwór fibrynogenu w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po określeniu całkowitej objętości zmierz absorbancję roztworu fibrynogenu przy 280 nanometrach, często konieczny jest współczynnik rozcieńczenia 50, aby uzyskać absorbancję poniżej jednego.

Obliczyć stężenie białka obecnego w roztworze fibrynogenu, stosując następujące równanie, w którym stężenie fibrynogenu w miligramach na mililitr jest równe dwóm 80-krotnym współczynnikom rozcieńczenia podzielonym przez 1,55, gdzie 1,55 jest współczynnikiem ekstynkcji przy dwóch 80 dla ludzkiego fibrynogenu. Następnie oblicz ilość TBS potrzebną do rozcieńczenia stężenia roztworu do 11,1 miligrama na mililitr fibrynogenu w oparciu o początkową objętość. Końcowe stężenie białka w rusztowaniach fibrynowych wyniesie 10 miligramów na mililitr.

Po polimeryzacji dodać 15 mikrolitrów roztworu trombiny o stężeniu 40 jednostek na mililitr po prawej stronie każdej studzienki w pierwszym rzędzie płytki 24-dołkowej, a następnie dodać 15 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu chlorku wapnia po lewej stronie każdej z nich. Na koniec dodaj 270 mikrolitrów roztworu fibrynogenu na płytkę. Potrząśnij płytką z boku na bok i z tyłu do przodu, aby wymieszać roztwory.

Pozwól rządowi zawierającemu mieszaniny polimeryzować przez pięć minut W temperaturze pokojowej rusztowania stają się bardziej nieprzezroczyste w miarę polimeryzacji, kontynuując tworzenie rzędów spolimeryzowanego fibrynogenu pojedynczo, aż do uzyskania pożądanej liczby rusztowań fibrynowych. Po ostatniej pięciominutowej inkubacji inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby całkowicie spolimeryzować rusztowania. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji.

Zasiej rusztowanie za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby wybrać indywidualne ciało zarodka i umieścić je w środku rusztowania fibrynowego. Sprawdź pod mikroskopem, czy każda studzienka zawiera pojedynczy korpus zarodka. Dodaj pięć mikrolitrów roztworu trombiny i pięć mikrolitrów 50-milimolowego roztworu chlorku wapnia na wierzch każdego ciała zarodka, a następnie 90 mikrolitrów roztworu fibrynogenu do każdej studzienki, roztwór powinien utworzyć bańkę otaczającą ciało zarodka.

Inkubować płytkę przez dodatkową godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapewnić polimeryzację po inkubacji, dodać jeden mililitr odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W tym miejscu pokazano reprezentatywne obrazy indukowanych przez myszy pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na warstwach żywiących mysie embrionalne fibroblasty. Stosując ośmiodniowy protokół leczenia kwasem retinowym, komórki są indukowane do tworzenia ciał zarodkowych, agregatów komórek zawierających progenitory nerwowe, jak pokazano tutaj.

Rysunek ten przedstawia wygląd ciała zarodka pochodzącego z IPS po trzech dniach hodowli w rusztowaniach fibrynowych 3D. Podobne wyniki uzyskano wcześniej przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak umieszczać ciała zarodków w rusztowaniach fibrynowych 3D za pomocą tego dwudniowego procesu.

Nie zapominaj, że praca z fibrynogenem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, w tym noszenie środków ochrony osobistej i odpowiednią utylizację odpadów.