Indukcja zawału mięśnia sercowego u dorosłych danio pręgowanego za pomocą kriouszkodzenia

W przeciwieństwie do ludzi, danio pręgowany może zregenerować serce po urazie. Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest scharakteryzowanie regeneracji serca danio pręgowanego w odpowiedzi na zawał mięśnia sercowego. Osiąga się to poprzez wywołanie zawału serca za pomocą techniki zwanej urazem cryin, która niszczy około 20% komory po określonym okresie rekonwalescencji.

Serca są zbierane i mocowane, a postęp regeneracji serca w różnych punktach czasowych jest oceniany. Następnie utrwalone serca są dzielone na powtórzenia w celu wykonania różnych analiz tej samej próbki, uzyskuje się wyniki, które pokazują różne komórkowe i molekularne aspekty procesu regeneracyjnego z wykorzystaniem histalologii, barwienia, situ do hybrydyzacji i immunofluorescencji. Główną zaletą techniki ponownego uszkodzenia naszych istniejących metod u danio pręgowanego, takich jak częściowa amputacja wierzchołka komory, jest to, że powoduje ona rozległą śmierć komórek w dużej części mięśnia sercowego.

W rzeczywistości szybkie swobodne przechowywanie tkanki naśladuje fizjologiczne reakcje zawału wywołanego niedokrwieniem obserwowane u ludzi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii regeneracyjnej, takie jak czynniki stymulujące proliferację kardiomiocytów u danio pręgowanego. W jaki sposób uszkodzone serce może utrzymać swoją żywotną aktywność skurczową podczas rozległej przebudowy tkanki, która obejmuje przejściowe odkładanie się blizn i odrastanie utraconego mięśnia sercowego?

W jaki sposób te przeciwstawne reakcje komórkowe zwłóknienia i tworzenia się nowego mięśnia sercowego są skoordynowane, aby osiągnąć pełną regenerację serca u danio pręgowanego? Implikacje tej techniki zmierzają w kierunku lepszego zrozumienia, dlaczego ssaki wykazują słabą zdolność akcyjną w porównaniu z danio pręgowanym. Technika uszkodzenia kryliny zostanie zaprezentowana przez Fabiana Shale'a, doktoranta, który opracował tę technikę w naszym laboratorium. Serce.

Sekcja zostanie następnie zademonstrowana przez Zimmermana, naszego asystenta technicznego, aby przygotować się do kriochirurgii. Przygotuj mikroskop stereoskopowy, ostre kleszcze, mikro, nożyczki sprężynowe do preparowania i plastikową pipetę transferową. Ponadto przygotuj zlewkę do znieczulenia ryby i plastikową łyżkę do przenoszenia.

Głównym narzędziem używanym do wykonania operacji jest sonda kriogeniczna, instrument przypominający długopis wykonany ze stali nierdzewnej, aby uniknąć odmrożeń podczas wykonywania zabiegu, użyj plastikowej rurki i taśmy do obsługi sondy w celu utrzymania ryby w stabilnej pozycji. Podczas zabiegu wytnij rowek w wilgotnej gąbce. Ustaw podwójny timer najpierw z dziesięciosekundowym odliczaniem, a następnie automatycznie z 24-sekundowym odliczaniem.

Aby rozpocząć procedurę kriourazu. Najpierw schłodzić sondę kriogeniczną, zanurzając końcówkę w ciekłym azocie na co najmniej trzy minuty na trzy do pięciu centymetrów. Znieczulenie i dorosłego danio pręgowanego poprzez zanurzenie go w 0,02% trica, aż ryba obróci się na grzbiet i skrzela.

Prawie przestań się ruszać. Za pomocą plastikowej łyżki przenieś rybę do rowka wilgotnej gąbki brzuszną stroną do góry. Ręką niedominującą trzymaj rybę stabilnie kleszczami.

Następnie wizualnie zlokalizuj tylny przyśrodkowy brzeg serca i użyj prostych nożyczek do irydektomii, aby nakłuć skórę. Następnie wykonaj małe nacięcie nad sercem, przecinając prosto w kierunku przednim przez skórę i mięśnie. Czubkiem nożyczek delikatnie oderwij srebrzystą warstwę nabłonka tkanki podskórnej, aby mieć bezpośredni dostęp do bijącej komory.

Nie wkładaj nożyczek głębiej w jamę ciała, ponieważ spowoduje to przebicie serca. Bijące serce powinno być dobrze widoczne, a podczas torakotomii nie powinno wystąpić rozległe krwawienie. Uruchom zaprogramowany timer W ciągu pierwszych 10 sekund wyjmij sondę kriogeniczną z ciekłego azotu i delikatnie nią potrząśnij, aby usunąć azot.

Następnie użyj kleszczy, aby otworzyć klatkę piersiową, bocznie rozsuwając nacięcie. Gdy wyłączy się dziesięciosekundowy timer, natychmiast i delikatnie użyj końcówki wstępnie chłodnej sondy kriogenicznej, aby dotknąć komory. Sonda powinna być precyzyjnie umieszczona na sercu, aby zapewnić ścisły kontakt z komorą.

Aby to osiągnąć, komora powinna być dokładnie umieszczona w środku nacięcia. Gdy zegar zadzwoni po 24 sekundach, użyj plastikowej pipety, aby wlać dwa do trzech mililitrów wody systemowej na klatkę piersiową, aby uwolnić sondę kriogeniczną z tkanki i przenieść rybę do zbiornika z wodą systemową. Jeśli nie oddycha, po około 45 sekundach stymuluj zwierzę za pomocą plastikowej pipety, aby wlać wodę do skrzeli, aż zacznie samodzielnie oddychać, aby zebrać i naprawić serce.

Najpierw przygotuj jeden mililitr 2% forminy w mikro tubce fuge. Przygotuj również dwa kleszcze, mikro, nożyczki preparacyjne i wilgotną gąbkę szczelinową w wybranym dniu. Po urazie kriogenicznym rybę poddać eutanazji w 0,1% trica przez pięć minut.

Umieść rybę brzuszną stroną do góry w gąbce za pomocą mikronożyczek preparujących. Wykonaj duże nacięcie nad sercem przez chrząstkę ramienną. Użyj kleszczy, aby szeroko otworzyć nacięcie.

Następnie uszczypnij tętnicę opuszki, białą strukturę przed komorą i usuń serce z jamy, ciągnąc je w celu zamocowania. Umieść do trzech serc w tubce z 2%Formin. Delikatnie obróć rurkę kilka razy i trzymaj ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby przygotować serca do montażu, płucz je w PBS przez pięć minut. Następnie przenieś je do 10 mililitrów wstępnie schłodzonej, 30% sacharozy. Inkubuj serca przez godzinę i 20 minut.

W czterech stopniach Celsjusza serca opadną na dno tuby. Następnie przygotuj pudełko z suchym lodem. Następnie wlej pięciomilimetrową warstwę podłoża montażowego OCT na dno formy do zatapiania.

Za pomocą kleszczy umieść serce w pożywce OCT w formie pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw serce tak, aby wierzchołek komory znajdował się na dnie formy, a bulwiasta tętnica była skierowana do góry. Następnie umieść foremkę na suchym lodzie na kilka minut, aż OCT zamarznie.

Następnie dodaj więcej OCT, aby wypełnić formę. Ustaw kriostat o wielkości cięcia 16 mikronów, temperaturze komory minus 24 stopnie Celsjusza i temperaturze próbki minus 22 stopnie Celsjusza. Umieść zamrożony blok z próbką w kriosacie i ustal jego orientację tak, aby cięcie rozpoczynało się równolegle do dna bloku.

Przygotuj sześć super frostów plus szkiełka na blok i ponumeruj je od jednego do sześciu. Rozpocznij cięcie, aż do dotarcia do tkanki, a następnie użyj żyletki, aby przyciąć blok wokół próbki Aby uzyskać sześć powtórzeń jednego serca, weź pierwszą sekcję na szkiełku pierwszym, drugą sekcję na szkiełku drugim, trzecią na szkiełku trzecim i tak dalej. Gdy szósta sekcja zostanie umieszczona na slajdzie szóstym, uruchom ponownie od slajdu pierwszego i kontynuuj, aż cały narząd zostanie przecięty.

Zbierz dwa rzędy po osiem sekcji na szkiełku. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowuj je przez okres do jednego roku w szczelnie zamkniętych pudełkach w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza Pokazany tutaj jest reprezentatywnym uszkodzeniem serca w wypreparowanym całym sercu cztery dni po urazie kriogenicznym.

Do wizualizacji tkanki mięśnia sercowego vivo transgenicznych ryb eksprymujących EGFP i jądrowe dazs użyto czerwonych dwóch pod kontrolą specyficznego dla serca promotora CM C. Brak eeg, FP i DS czerwonych, dwa sygnały fluorescencyjne wyznaczały strefę zawału w kształcie dysku wzdłuż wierzchołkowej ściany bocznej komory, aby określić zakres regeneracji serca w porównaniu z bliznowaceniem. Przeprowadzono analizę histologiczną z zastosowaniem barwienia kwasem fusion orange GS, które w różny sposób znakuje tkanki sercowe i zwłóknieniowe.

Zdrowe komórki mięśniowe są oznaczone kolorem pomarańczowym. Analizy ekspresji genów w tkance bliznowatej zawierającej kolagen w kolorze niebieskim i fibrynę w kolorze czerwonym przeprowadzono z wykorzystaniem wglądu w hybrydyzację. Miozyna komorowa.

MRNA o ciężkim łańcuchu z nienaruszonego mięśnia sercowego jest tutaj widoczne na niebiesko. Uszkodzona tkanka jest pozbawiona transkryptu genu serca. Na tym rysunku immunofluorescencyjne barwienie mycyny TRO pokazane na zielonych etykietach nienaruszone kardiomiocyty i nieuszkodzona tkanka.

Jądra są wybarwione DPI i są pokazane na niebiesko w tym panelu, genetycznie oznaczone kardiomiocyty wyrażają się. DS RED dwa w swoich jądrach, DAPI znakuje wszystkie jądra. Jednak strefa zawału nie zawiera DS czerwonego.

Dwie dodatnie komórki. Po mistrzowskim odczytaniu, uraz cryin pojedynczej ryby może zostać wykonany w mniej niż pięć minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o precyzyjnym umieszczeniu wywołanej sondy kriogenicznej na vle na optymalny czas po opracowaniu techniki kriouszkodzenia.

Metoda ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią regeneracyjną do zbadania mechanizmów leżących u podstaw naturalnej odbudowy serca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zawał mięśnia sercowego u ryb RKO za pomocą kriourazu.