Name: Elektroforeza w żelu agarozowym do separacji fragmentów DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj elektroforezę w żelu agarozowym do separacji fragmentów DNA w biologii molekularnej. Ta metoda umożliwia wizualizację pasm DNA i precyzyjne określenie ich rozmiarów w zakresie od 100 do 25 000 par zasad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie żelu
<ol>
	<li>Odważ odpowiednią masę agarozy do kolby Erlenmeyera. Żele agarozowe przygotowuje się jako roztwór o określonym stężeniu procentowym masy do objętości (w/v). Stężenie agarozy w żelu zależy od rozmiarów fragmentów DNA, które mają zostać rozdzielone; większość żeli ma stężenie od 0,5% do 2%. Objętość buforu nie powinna przekraczać 1/3 pojemności kolby.</li>
	<li>Do kolby z agarozą dodaj bufor do elektroforezy. Zamieszaj przez delikatne potrząśnięcie kolby. Najczęściej stosowanymi buforami do prowadzenia żeli są TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) oraz TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Rozpuść mieszaninę agarozy i buforu. Najczęściej wykonuje się to poprzez podgrzewanie w mikrofalówce, ale można to również przeprowadzić nad palnikiem Bunsena. Co 30 s wyjmuj kolbę i potrząśnij jej zawartością, aby dokładnie wymieszać składniki. Powtarzaj czynność do całkowitego rozpuszczenia agarozy.</li>
	<li>Dodaj bromek etydyny (EtBr) do uzyskania stężenia 0,5 μg/ml. Alternatywnie żel można barwić po elektroforezie w buforze do prowadzenia zawierającym 0,5 μg/ml EtBr przez 15-30 min, a następnie odbarwić w buforze do prowadzenia przez taki sam czas.</li>
</ol>
Uwaga: EtBr jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i musi być utylizowany zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Podczas pracy z żelami zawierającymi EtBr należy zawsze nosić rękawiczki. Dostępne są alternatywne barwniki do barwienia DNA, jednak EtBr pozostaje najpopularniejszym z nich ze względu na swoją czułość i koszt.
<ol start="5">
	<li>Pozostaw agarozę do ostygnięcia na blacie lub w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C. Niedopełnienie tego kroku spowoduje odkształcenie tacki do żelu.</li>
	<li>Umieść tackę do żelu w aparaturze do odlewania. Alternatywnie można zakleić otwarte krawędzie tacki taśmą, aby stworzyć formę. Włóż odpowiedni grzebień do formy do żelu, aby utworzyć dołki.</li>
	<li>Wlej roztopioną agarozę do formy do żelu. Pozostaw agarozę do zastygnięcia w temperaturze pokojowej. Usuń grzebień i umieść żel w kasecie do elektroforezy. Alternatywnie żel można owinąć folią spożywczą i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (Rys. 1).</li>
</ol>

2. Przygotowanie aparatury do elektroforezy żelowej i rozdział fragmentów DNA
<ol>
	<li>Do próbek DNA przeznaczonych do rozdziału dodać barwnik do ładowania (Rys. 2). Barwnik do ładowania żelu przygotowuje się zazwyczaj w stężeniu 6X (0,25% błękitu bromfenolowego, 0,25% cyjanolu ksylenowego, 30% glicerolu). Barwnik umożliwia śledzenie stopnia migracji próbki DNA oraz sprawia, że próbka opada na dno studzienki żelowej.</li>
	<li>Ustawić zasilacz na pożądane napięcie (1-5V/cm pomiędzy elektrodami).</li>
	<li>Dolać odpowiednią ilość buforu do elektroforezy, aby pokrył on powierzchnię żelu. Ważne jest, aby użyć tego samego buforu, który posłużył do przygotowania żelu.</li>
	<li>Podłączyć przewody komory elektroforetycznej do zasilacza. Włączyć zasilacz i sprawdzić, czy komora oraz zasilacz działają prawidłowo.</li>
	<li>Zdjąć pokrywę. Powoli i ostrożnie nanieść próbkę(i) DNA na żel (Rys. 3). Wraz z próbkami badawczymi należy zawsze nanosić odpowiedni marker wielkości DNA.</li>
	<li>Założyć pokrywę komory elektroforetycznej. Katoda (czarne przewody) powinna znajdować się bliżej studzienek niż anoda (czerwone przewody). Ponownie sprawdzić, czy elektrody są podłączone do właściwych gniazd w zasilaczu.</li>
	<li>Włączyć zasilanie. Prowadzić elektroforezę do momentu, aż barwnik zmigruje na odpowiednią odległość.</li>
</ol>
3. Obserwacja rozdzielonych fragmentów DNA
<ol>
	<li>Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilacz i zdejmij pokrywę komory do elektroforezy.</li>
	<li>Wyjmij żel z komory. Odlej nadmiar buforu z powierzchni żelu. Połóż kasetę z żelem na ręcznikach papierowych, aby wchłonęły pozostały bufor do elektroforezy.</li>
	<li>Wyjmij żel z kasety i naświetl go promieniami UV. Najczęściej wykonuje się to przy użyciu systemu dokumentacji żeli (Ryc. 4). Prążki DNA powinny być widoczne jako pomarańczowe pasma fluorescencyjne. Wykonaj zdjęcie żelu (Ryc. 5).</li>
	<li>Utylizuj żel oraz bufor do elektroforezy zgodnie z regulacjami obowiązującymi w danej instytucji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Rycina 5 przedstawia typowy wynik po elektroforezie produktów PCR w żelu agarozowym. Po rozdzieleniu powstałe fragmenty DNA są widoczne jako wyraźnie zdefiniowane prążki. Standard DNA lub drabinka powinny zostać rozdzielone w stopniu umożliwiającym przydatne oznaczenie wielkości prążków w próbkach. W przedstawionym przykładzie fragmenty DNA o wielkości 765 bp, 880 bp i 1022 bp zostały rozdzielone w 1,5% żelu agarozowym wraz z drabinką DNA 2-log.
<img alt="Układ do elektroforezy; kasetka do żelu; rozdział DNA; eksperyment biologii molekularnej; sprzęt laboratoryjny" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Stężały żel agarozowy po usunięciu grzebienia.
<img alt="Technika pipetowania w eksperymencie laboratoryjnym, probówki PCR, przygotowanie próbek DNA, sprzęt laboratoryjny." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. Studentka dodająca barwnik ładujący do swoich próbek DNA.
<img alt="Układ do elektroforezy żelowej, metoda rozdzielania DNA, nakładanie próbki do żelu pipetą, eksperyment laboratoryjny." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. Student nakładający próbkę DNA do oczka w żelu.
<img alt="Stacja robocza do obrazowania elektroforezy żelowej do analizy DNA, obejmuje komputer i sprzęt do obrazowania." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4."> 
Rycina 4. Przykład systemu dokumentacji żelowej.
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej, prążki DNA z markerami drabinki 2-log, rozdział według masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5."> 
Rycina 5. Obraz żelu po elektroforezie. Przed elektroforezą do żelu dodano EtBr do stężenia końcowego 0,5 μg/ml, a następnie przeprowadzono rozdział przy 100 V przez 1 godzinę. Żel naświetlono światłem UV, a zdjęcie wykonano za pomocą systemu dokumentacji żeli.

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%22">Molecular Cloning</a>. , 3rd, (2001).</li>
<li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+agarose+gel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis+of+large+DNA+molecules%3A+theory+and+applications%22%5BJournal%5D)">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li>
<li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endonuclease+R%E2%80%A2EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li>
<li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li>
<li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+electrophoresis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li>
<li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li>
<li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDevor%2C+EJ+%22IDT+tutorial%3A+gel+electrophoresis%22">IDT tutorial: gel electrophoresis</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf">http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf</a> (2010).</li>
<li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gels%3A+properties+and+use+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li>
<li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion%3A+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose%2C+carrageenan+and+galactomannans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li>
<li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Elektroforeza w żelu agarozowym okazała się wydajnym i skutecznym sposobem rozdzielania kwasów nukleinowych. Wysoka wytrzymałość agarozy pozwala na stosowanie żeli o niskim stężeniu do rozdzielania dużych fragmentów DNA. Przesiewanie molekularne jest determinowane przez rozmiar porów tworzonych przez wiązki agarozy7 w matrycy żelowej. Generalnie, im wyższe stężenie agarozy, tym mniejszy rozmiar porów. Tradycyjne żele agarozowe są najskuteczniejsze w rozdzielaniu fragmentów DNA o wielkości od 100 bp do 25 kb. Do rozdzielania fragmentów DNA większych niż 25 kb konieczne jest zastosowanie elektroforezy w polu impulsowym6, która polega na przyłożeniu prądu zmiennego z dwóch różnych kierunków. W ten sposób większe fragmenty DNA są rozdzielane w zależności od prędkości, z jaką reorientują się one wraz ze zmianą kierunku prądu. Fragmenty DNA mniejsze niż 100 bp są skuteczniej rozdzielane przy użyciu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. W przeciwieństwie do żeli agarozowych, matryca żelu poliakryloamidowego powstaje w wyniku reakcji chemicznej inicjowanej przez wolne rodniki. Żele te są cieńsze, mają wyższe stężenie, są prowadzone pionowo i charakteryzują się lepszą rozdzielczością. W nowoczesnym sekwencjonowaniu DNA stosuje się elektroforezę kapilarną, w której rurki kapilarne są wypełnione matrycą żelową. Zastosowanie kapilar pozwala na przyłożenie wysokiego napięcia, co umożliwia szybkie rozdzielanie fragmentów DNA (i ustalenie sekwencji DNA).
Agarozę można zmodyfikować w celu otrzymania agarozy niskotopliwej poprzez hydroksyetylację. Agarozę niskotopliwą stosuje się zazwyczaj wtedy, gdy pożądaną jest izolacja rozdzielonych fragmentów DNA. Hydroksyetylacja zmniejsza gęstość upakowania pęczków agarozy, co skutecznie redukuje wielkość ich porów8. Oznacza to, że fragment DNA o tej samej wielkości będzie poruszał się przez żel z agarozy niskotopliwej dłużej niż przez standardowy żel agarozowy. Ponieważ pęczki te łączą się ze sobą poprzez oddziaływania niekowalencyjne9, możliwe jest ponowne stopienie żelu agarozowego po jego zastygnięciu.
EtBr jest najpowszechniejszym odczynnikiem stosowanym do barwienia DNA w żelach agarozowych10. Po naświetleniu światłem uv elektrony w pierścieniu aromatycznym cząsteczki etydium ulegają aktywacji, co prowadzi do uwalniania energii (światła) podczas powrotu elektronów do stanu podstawowego. EtBr działa poprzez interkalację w cząsteczkę DNA w sposób zależny od stężenia. Pozwala to na oszacowanie ilości DNA w konkretnym prążku DNA na podstawie jego intensywności. Ze względu na ładunek dodatni, zastosowanie EtBr zmniejsza szybkość migracji DNA o 15%. EtBr jest podejrzenie mutagenny i rakotwórczy, dlatego należy zachować ostrożność podczas pracy z żelami agarozowymi go zawierającymi. Ponadto EtBr jest uznawany za odpad niebezpieczny i musi być utylizowany w odpowiedni sposób. Alternatywne barwniki do DNA w żelach agarozowych obejmują SYBR Gold, SYBR green, fiolet krystaliczny i błękit metylowy. Spośród nich błękit metylowy i fiolet krystaliczny nie wymagają naświetlania żelu światłem uv w celu wizualizacji prążków DNA, co zmniejsza prawdopodobieństwo mutacji, jeśli planowane jest odzyskanie fragmentu DNA z żelu. Jednak ich czułość jest niższa niż w przypadku EtBr. SYBR gold i SYBR green to wysoko czułe barwniki zależne od uv o niższej toksyczności niż EtBr, lecz są one znacznie droższe. Co więcej, wszystkie alternatywne barwniki albo nie mogą być dodawane bezpośrednio do żelu, albo nie działają w ten sposób wystarczająco dobrze, dlatego żel musi zostać zabarwiony po elektroforezie. Ze względu na koszt, łatwość użycia i czułość, EtBr pozostaje preferowanym barwnikiem dla wielu badaczy. Jednak w określonych sytuacjach, np. gdy utylizacja odpadów niebezpiecznych jest utrudniona lub gdy eksperyment wykonują młodzi studenci, preferowany może być barwnik o mniejszej toksyczności.
Barwniki do nakładania próbek stosowane w elektroforezie żelowej służą trzem głównym celom. Po pierwsze, zwiększają gęstość próbki, co pozwala jej opaść na dno otworu w żelu. Po drugie, barwniki nadają kolor i ułatwiają proces nakładania. Wreszcie, barwniki przemieszczają się przez żel z określoną prędkością, co umożliwia oszacowanie odległości, o jaką przemieściły się fragmenty DNA.
Dokładne wielkości rozdzielonych fragmentów DNA można określić, wykreślając logarytm masy cząsteczkowej dla poszczególnych prążków standardu DNA w funkcji odległości, jaką przebył każdy prążek. Standard DNA zawiera mieszaninę fragmentów DNA o znanych wielkościach, które mogą służyć do porównania z badanymi próbkami DNA. Należy zauważyć, że różne formy DNA przemieszczają się przez żel z różną prędkością. Superzwinięte plazmidowe DNA, ze względu na swoją zwartą konformację, przemieszcza się przez żel najszybciej, następnie przemieszcza się liniowy fragment DNA tej samej wielkości, a najwolniej forma kolista otwarta.
Podsumowując, od czasu wprowadzenia żeli agarozowych do separacji DNA w latach 70. XX wieku, technika ta okazała się jedną z najużyteczniejszych i najbardziej wszechstronnych metod w badaniach nauk biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Agaroza I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td> wird Bromek etylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Rakotwórczy&amp;#8212;wymaga utylizacji jako odpad niebezpieczny</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401-212</td><td>Żrący</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Xylen cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>System dokumentacji żeli Investigator/FX</td><td>Fotodyne Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy żelowej Owl Easycast B1 mini</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>B1-PTM</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz EPS 301</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1130-01</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów dna

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Elektroforeza w żelu agarozowym jest najskuteczniejszą metodą rozdzielania fragmentów DNA o różnych rozmiarach, od 100 bp do 25 kb1. Agarozę izoluje się z wodorostów z rodzajów Gelidium i Gracilaria; składa się ona z powtarzających się podjednostek agarobiozy (L- i D-galaktozy)2. Podczas żelowania polimery agarozy łączą się niekowalencyjnie, tworząc sieć wiązek, których wielkość porów determinuje właściwości przesiewania molekularnego żelu. Zastosowanie elektroforezy w żelu agarozowym zrewolucjonizowało rozdzielanie DNA. Przed wprowadzeniem żeli agarozowych DNA rozdzielano głównie za pomocą wirowania w gradientowym stężeniu sacharozy, co pozwalało jedynie na przybliżone określenie rozmiaru. Aby rozdzielić DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, próbki DNA nanosi się do wcześniej przygotowanych dołków w żelu, a następnie przykłada prąd elektryczny. Szkielet fosforanowy cząsteczki DNA (i RNA) jest naładowany ujemnie, dlatego po umieszczeniu w polu elektrycznym fragmenty DNA migrują w stronę dodatnio naładowanej anody. Ponieważ DNA ma jednolity stosunek masy do ładunku, cząsteczki DNA w żelu agarozowym są rozdzielane według rozmiaru w taki sposób, że przebyta odległość jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu ich masy cząsteczkowej3. Przewodni model ruchu DNA przez żel agarozowy to &#34;biased reptation&#34; (ukierunkowane pełzanie), w którym krawędź prowadząca przesuwa się naprzód, wciągając za sobą resztę cząsteczki4. Szybkość migracji cząsteczki DNA przez żel jest określana przez następujące czynniki: 1) rozmiar cząsteczki DNA; 2) stężenie agarozy; 3) konformacja DNA5; 4) przyłożone napięcie; 5) obecność bromku etydyny; 6) rodzaj agarozy oraz 7) bufor elektroforetyczny. Po rozdzieleniu cząsteczki DNA można zwizualizować w świetle UV po zabarwieniu odpowiednim barwnikiem. Postępując zgodnie z niniejszym protokołem, studenci powinni być w stanie: 
 
1. Zrozumieć mechanizm, dzięki któremu fragmenty DNA są rozdzielane w matrycy żelowej 
2. Zrozumieć, w jaki sposób konformacja cząsteczki DNA wpływa na jej mobilność w matrycy żelowej 
3. Dobrać roztwór agarozy o stężeniu odpowiednim do ich potrzeb 
4. Przygotować żel agarozowy do elektroforezy próbek DNA 
5. Przygotować aparat do elektroforezy żelowej oraz zasilacz 
6. Wybrać odpowiednie napięcie do rozdzielenia fragmentów DNA 
7. Zrozumieć mechanizm, dzięki któremu bromek etydyny umożliwia wizualizację prążków DNA 
8. Określić rozmiary rozdzielonych fragmentów DNA 
&#160;

Opisano podstawowy protokół rozdzielania fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów DNA

Elektroforeza w żelu agarozowym jest najskuteczniejszą metodą rozdzielania fragmentów DNA o różnych rozmiarach, mieszczących się w zakresie od 100 bp do 25 kb1. Agaroza jest izolowana z ...

Ogólnym celem tej procedury jest rozdzielenie fragmentów DNA o różnych rozmiarach. Osiąga się to poprzez przygotowanie żelu o odpowiednim stężeniu agarozy i barwnika fluorescencyjnego. Drugim krokiem jest wlanie żelu do odpowiedniej formy i pozostawienie go do zastygnięcia.Próbki nanosi się na żel, a następnie przykłada prąd. Ostatnim krokiem jest wizualizacja rozdzielonych fragmentów DNA w świetle ultrafioletowym. Podsumowując, elektroforeza w żelu AGROS jest stosowana we wszystkich sytuacjach, w których wymagane jest rutynowe rozdzielanie fragmentów DNA.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z ówczesnymi metodami, takimi jak wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy, jest możliwość wizualizacji prążków DNA, a także określenie dokładnej wielkości fragmentu DNA podczas jednoczesnego rozdziału z markerem DNA. Metoda ta jest niezbędna w badaniach nad naukami o życiu, m.in. w klonowaniu genów oraz oczyszczaniu i sekwencjonowaniu cząsteczek DNA. Choć metoda ta jest zazwyczaj stosowana do rozdziału fragmentów DNA o wielkości od 100 par zasad do 25 kb, można ją zmodyfikować w celu rozdziału fragmentów DNA o rozmiarach do 10 Mb.Żele agarozowe przygotowuje się, stosując roztwór o stężeniu procentowym masy do objętości. Stężenie agarozy w żelu zależy od wielkości fragmentów DNA, które mają zostać rozdzielone. Aby rozpocząć procedurę przygotowania żelu, odważ odpowiednią masę agarozy do kolby Erlenmeyera, a następnie dodaj do kolby odpowiednią objętość buforu do elektroforezy.Objętość buforu nie powinna przekraczać jednej trzeciej pojemności kolby. Zakręć kolbą w celu wymieszania, a następnie rozpuść mieszaninę buforu z agarozą, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej na maksymalnej mocy. W odstępach 30-sekundowych wyjmuj kolbę i potrząśnij jej zawartością, aby wymieszać składniki. Powtarzaj tę czynność, aż agaroza całkowicie się rozpuści.Następnie dodaj bromek aterium do uzyskania stężenia 0,5 µg/ml. Należy pamiętać, że bromek aterium jest substancją rakotwórczą, dlatego podczas pracy z żelami zawierającymi bromek aterium należy zawsze nosić rękawiczki. Pozostaw agar do ostygnięcia, inkubując go w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C. Niedopełnienie tego kroku spowoduje odkształcenie tacki do żelu podczas stygnięcia agaru.Przygotuj formę do żelu, umieszczając kasetę do żelu w aparacie do odlewania. Alternatywnie można zakleić wolne krawędzie kasety taśmą, aby stworzyć formę. Włóż odpowiedni grzebień do formy, aby utworzyć oczka.Wlej formę i arosy do formy żelowej. Pozostaw arosy do zastygnięcia w temperaturze pokojowej. Po zastygnięciu arosów wyjmij grzebień.Jeśli żel nie zostanie użyty natychmiast, należy go owinąć folią spożywczą i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia. Jeśli żel ma zostać użyty natychmiast, należy umieścić go w kasecie do elektroforezy. Aby rozpocząć procedurę, należy dodać barwnik do ładowania próbek do próbek DNA przeznaczonych do rozdziału.Barwnik do nakładania próbek przygotowuje się zazwyczaj w stężeniu 6x. Po ustawieniu zasilacza na odpowiednie napięcie, należy wlać do komory elektroforetycznej wystarczającą ilość buforu do elektroforezy, aby przykryć powierzchnię żelu. Ważne jest użycie tego samego buforu, który posłużył do przygotowania żelu. Następnie należy podłączyć przewody komory do zasilacza i włączyć urządzenie. Należy sprawdzić, czy zarówno komora elektroforetyczna, jak i zasilacz działają prawidłowo.Pojawienie się pęcherzyków powietrza przy elektrodach świadczy o przepływie prądu. Ponieważ dłonie mają naturalną tendencję do lekkiego drżenia, wprowadzenie końcówki małej pipety do wąskiego otworu może być trudne. Jednym ze sposobów na zminimalizowanie drżenia dłoni jest oparcie jej o drugie ramię lub o pudełko z gelem.Powoli i ostrożnie zdejmij pokrywę kasety do żelu. Naładuj próbki DNA do żelu. Barwnik do ładowania zawarty w próbce pozwala jej opaść na dno wgłębienia w żelu i pomaga śledzić dystans, jaki przebyła próbka. Wraz z próbkami doświadczalnymi należy zawsze naładować marker wielkości DNA.Załóż pokrywkę. Upewnij się, że elektrody są podłączone do właściwych gniazd w zasilaczu. Włącz zasilanie i prowadź elektroforezę żelu, aż barwnik przemieści się na odpowiednią odległość.Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilacz i zdejmij pokrywę komory do elektroforezy. Wyjmij żel z komory i odlej nadmiar buforu z jego powierzchni. Połóż tackę z żelem na ręcznikach papierowych, aby wchłonęły pozostały bufor do elektroforezy.Aby zwizualizować fragmenty DNA, należy wyjąć żel z formy i poddać go działaniu światła ultrafioletowego. Najczęściej wykonuje się to przy użyciu systemu dokumentacji żeli. Prążki DNA powinny być widoczne jako pomarańczowe prążki fluorescencyjne.Na koniec eksperymentu wykonaj zdjęcie żelu, a następnie zutylizuj żel oraz bufor do elektroforezy zgodnie z przepisami instytucji. Rysunek ten przedstawia typowy wynik elektroforezy żelowej produktów PCR. Po rozdziale powstałe fragmenty DNA widoczne są jako wyraźnie zdefiniowane prążki.Standard lub drabinka DNA powinna zostać rozdzielona w stopniu umożliwiającym przydatne określenie rozmiarów prążków w próbce. W tym przykładzie fragmenty DNA o długości 765 par zasad, 880 par zasad i 1022 par zasad są rozdzielane w żelu 1,5% AROS przy użyciu drabinki DNA typu two log. Podczas wykonywania procedury należy pamiętać o ponownym sprawdzeniu rozmieszczenia elektrod przed przyłożeniem prądu.Ma to na celu zapewnienie, że cząsteczki DNA przemieszczają się w odpowiednim kierunku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować żel agarozowy, rozdzielić DNA oraz fragmenty o określonych rozmiarach i uzyskać reprezentatywne obrazy wyników. Pamiętaj, że praca z bromkiem etydyny może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, gogli i fartuchów laboratoryjnych.

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroforeza żelowa agarose w celu separacji fragmentów DNA

W tym filmie prezentujemy metodę elektroforetycznego rozdzielania białek z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Elektroforetyczne rozdział białek

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Tradycyjne eksperymenty z elektroforezą żelową (SGE) wymagają skomplikowanej aparatury i dużego zużycia chemikaliów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który opisuje tanią metodę separacji fragmentów DNA w krótkim czasie.

Śledzenie separacji fragmentów DNA w czasie rzeczywistym za pomocą smartfona

Tutaj prezentujemy protokół użycia oranżu tiazolowego do wykrywania DNA w eksperymentach z elektroforezą żelową. Zastosowanie oranżu tiazolowego pozwala na eliminację bromku etydyny, a detekcję fluorescencji można osiągnąć za pomocą światła UV lub niebieskiego.

Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

Elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (DGGE)

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika jest stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA lub RNA o długości do 500 nukleotydów. Mocznik w połączeniu z ciepłem denaturuje próbki, a nieustrukturyzowane pojedyncze nici migrują wewnątrz matrycy żelowej zgodnie z ich masą cząsteczkową.

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE)

Poznaj elektroforezę w żelu agarozowym do separacji fragmentów DNA w biologii molekularnej. Ta metoda umożliwia wizualizację pasm DNA i precyzyjne określenie ich rozmiarów w zakresie od 100 do 25 000 par zasad.

Elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów DNA

Przeglądaj więcej filmów