Wykorzystanie zwierzęcego modelu sepsy do oceny nowych terapii ziołowych

Sepsa odnosi się do zespołu ogólnoustrojowej reakcji zapalnej wynikającego z infekcji mikrobiologicznej i może być symulowana za pomocą techniki chirurgicznej zwanej podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego (CLP). W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystania modelu zwierzęcego indukowanego przez CLP do badania ziół leczniczych pod kątem środków terapeutycznych.

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie mysiego modelu sepsy za pomocą procedury chirurgicznej zwanej podwiązaniem i nakłuciem SQL lub CLP. Osiąga się to, wykonując najpierw 1,5 do dwucentymetrowego nacięcia linii środkowej na brzuchu myszy. Następnie seum jest odsłaniane i podwiązywane, a następnie surowica jest nakłuwana w celu wywołania translokacji bakteryjnej.

Na koniec nacięcie jest zamykane. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wykazują wzrost poziomu cytokin ogólnoustrojowych i otrzewnowych, a także objawy, takie jak letarg i śmiertelność. To, co zamierzam wam pokazać, to stworzenie mysiego modelu sepsy zwanego sation and punkcture, który jest zmodyfikowany w stosunku do oryginalnego modelu opracowanego przez dr Chandry'ego i jego współpracowników.

Główną zaletą tego modelu jest to, że jest to najbardziej odpowiedni model sepsy. Ponadto jest prosty, dobrze scharakteryzowany i ekonomicznie wykonalny, dlatego jest szeroko stosowany w dziedzinie badań nad sepsą i stanem zapalnym. Jako przykład pokażemy wykorzystanie tego modelu do oceny potencjału terapeutycznego ekstraktu ziołowego w sepsie.

Aby przygotować ekstrakt ziołowy, namocz 10 gramów ziół w 200 mililitrach wody o temperaturze 85 stopni Celsjusza przez jedną do czterech godzin, aby usunąć nierozpuszczalne cząstki, odwiruj frakcję wody o temperaturze 3, 300 G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przefiltruj supernatant przez filtr 0,2 mikrona. Następnie należy dalej zagęszczać filtrat za pomocą filtra odśrodkowego z odciętą masą cząsteczkową 10 000 kilodaltonów i wirować z prędkością 5 000 G przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wykorzystując hodowle makrofagów, przebadano frakcje o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej w celu hamowania aktywności późnych mediatorów prozapalnych, takich jak grupa o wysokiej mobilności box one lub HGB one. Aby rozpocząć izolację makrofagów, interperitoneal podał dwa mililitry bulionu glikolowego 4% TH normalnym myszom po trzech dniach zbierania pierwotnej hodowli makrofagów otrzewnowych, makrofagi w DMEM uzupełnione 10% FBS, dwiema milimolowymi glutaminami i 1% penicyliną. Streptomycyna delikatnie przemyć przylegające makrofagi optimum i inkubować je w tym samym pożywce przez dwie godziny.

Następnie stymuluj je bakteryjną endotoksyną lipopolisacharydem lub LPS 16 godzin po stymulacji. Zbierz pożywkę kondycjonowaną komórkowo i użyj jej do przeprowadzenia western blot. Aby zmierzyć poziomy HM GB jeden.

Określ ilościowo intensywność pasma za pomocą krzywej wzorcowej wygenerowanej za pomocą oczyszczonego H mgb jeden w celu ustalenia sepsy po znieczuleniu myszy wstrzyknięciem domięśniowym 75 miligramów na kilogram ketaminy i 20 miligramów na kilogram ksylazyny. I za pomocą szczypania palca u nogi, aby sprawdzić poziom uspokojenia. Umieść mysz w pozycji leżącej, oczyść brzuch, a następnie wykonaj 15-milimetrowe nacięcie linii środkowej, aby odsłonić jelito ślepe około pięciu milimetrów od końcówki kontynuacji za pomocą jedwabnego szwu four oh.

Podwiązać jelito ślepe, a następnie za pomocą igły o rozmiarze 22 nakłuć raz podwiązany kikut kontynuacyjny, aby umożliwić wyciskanie stolca, natychmiast przywróć jelito ślepe do normalnej pozycji śródbrzusznej i zamknij brzuch. Po tym, jak zwierzęta odzyskują przytomność i mobilność. Zwróć klatkę z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt po 24 godzinach.

Po CLP dootrzewnowo podawać 200 mikrolitrów ekstraktu ziołowego lub kontrolować codziennie przez trzy dni. Monitoruj zwierzę pod kątem przeżycia tak długo, jak jest to konieczne, w ciągu kilku godzin od sekwencyjnego podwiązania i nakłucia lub operacji CLP. Zwierzęta wykazują kliniczne objawy sepsy, które obejmują piloerekcję, letarg, skulenie się oraz zmniejszenie spożycia pokarmu i wody.

Zwierzęta, u których rozwija się ciężkie zapalenie otrzewnej z następczą infekcją ogólnoustrojową, zwykle umierają w ciągu 48 do 96 godzin. Jednak nawet wiek, płeć i pochodzenie genetyczne dopasowane zwierzęta mogą zareagować na operację w wyraźny sposób w trakcie eksperymentalnej sepsy, na przykład po 48 godzinach od CLP. Podczas gdy niektóre zwierzęta mogły zbliżyć się do stanu kopca, jak zdefiniowano tutaj, inne mogą pozostać w stanie niekonającym.

Kompleksowe badania krążących cytokin ujawniły dramatyczne różnice w poziomach kilku cytokin, w tym IL six, kc, MIP dwa i ST nfr, jednej między myszami w stanie agonalnym i niekonającym. Warto zauważyć, że te mediatory stanu zapalnego zostały sklasyfikowane jako zastępcze markery sepsy, ponieważ ich krążące poziomy są wiarygodnymi predyktorami śmiertelnego wyniku eksperymentalnej lub klinicznej sepsy. Ponadto CLP indukował miejscowe uwalnianie różnych cytokin i chemokin pro i przeciwzapalnych, na przykład po 48 godzinach od CLP znaczne ilości cytokiny IL 6 oraz chemokin KC i MI P 2 można nadal mierzyć nie tylko ogólnoustrojowo we krwi, ale także miejscowo w płynie z płukania otrzewnej.

W tym przypadku oceniano zdolności różnych ekstraktów ziołowych lub związków kontrolnych pod kątem ich zdolności do hamowania indukowanego endotoksynami uwalniania HGB one. Te, które miały zdolność hamowania uwalniania HGB one, były dalej testowane in vivo przy użyciu mysiego modelu sepsy. Ze względu na późną i przedłużoną kinetykę akumulacji HGB one w eksperymentalnej sepsie, pierwszą dawkę inhibitorów HGB one podano 24 godziny po wystąpieniu sepsy, w momencie, w którym myszy rozwinęły wyraźne objawy sepsy, w tym letarg, biegunkę i piloerekcję, jak pokazano tutaj, opóźnione i powtarzające się podawanie głównego zielonego składnika T epi Gallo, katechina trzecia GALLATE lub EGCG rozpoczynająca się po 24 godzinach od wystąpienia sepsy, znacznie uratowała myszy przed śmiertelną sepsą, nawet gdy podawano ją doustnie, EGCG nadal ratowała myszy przed śmiertelną sepsą, znacznie zwiększając wskaźniki przeżycia zwierząt z 16% do 44%Po opanowaniu tego podwiązania, a model nakłucia można zakończyć w mniej niż pięć minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.