Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie technik infekowania larw danio pręgowanego za pomocą patogenu grzybowego Candida albicans. Najpierw przygotowuje się fluorescencyjną kulturę grzybów i pokrywa zarodki ryb. Następnie ryby układa się w rzędzie na naczyniu do wstrzykiwań aros.

Candida albicans jest mikrowstrzykiwana przez ucho każdej ryby do tylnej komory mózgu rybaka, a następnie umieszczana w aeros o niskiej temperaturze topnienia i wizualizowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epi. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do nieinwazyjnego obrazowania interakcji patogenu gospodarza w złożonym środowisku gospodarza, a nie w uproszczonym systemie szalki Petriego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wstrzyknięcie żyły rozpieszczonej, jest to, że tworzy się miejscową infekcję, która skutkuje śmiertelną chorobą rozsianą.

Co więcej, technika ta pozwala na skuteczne wstrzykiwanie z natury dużych komórek C bucan do małych larw danio pręgowanego. Zacznij od nałożenia bulionu Candida albican na drożdżowy pońce. Płytka z agarem dekstrozy inkubuje płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić wzrost kolonii.

Gdy kolonie są widoczne, użyj sterylnego drewnianego kołka, aby wybrać izolowaną kolonię i rozpuść drożdże w pięciu mililitrach świeżego bulionu z dekstrozy drożdży Ekstrakt Pepto w probówkach hodowlanych o wymiarach 16 na 150 milimetrów. Umieść kulturę na bębnie rolkowym do hodowli tkankowych, wyposażonym w koło probówki i inkubatory na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś jeden mililitr kultury do 1,5 mililitrowej probówki i odwiruj ją 14 000 razy, G przez jedną minutę, aby osadzać komórki, a następnie wyrzuć supinat i wiruj osad, aby go poluzować.

Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze wiru PBS i ponownie je odwiruj. Następnie wyrzuć supinat i powtórz to pranie. Zrób trzy kroki, aby usunąć resztki pożywki hodowlanej.

Po umyciu komórek policz je w cytometrze hemologicznym w rozcieńczeniu od jednego do 100 w PBS. W przypadku 12-godzinnej hodowli należy spodziewać się od trzech do czterech razy od 10 do ośmiu komórek na mililitr. Reese's zgina drożdże w końcowym stężeniu od 10 do siedmiu komórek na mililitr.

Za pomocą sitka zebrać zarodki zebry danio pręgowanego ze zbiornika tarłowego w dniu poprzedzającym wstrzyknięcie i przechowywać je w roztworze wody jajecznej zawierającym 60 miligramów na mililitr rozpuszczalnych soli oceanicznych w sterylnej wodzie dejonizowanej. Następnie umieść zarodki w 33 stopniach SIU na 24 godziny z 12-godzinnym cyklem jasnej ciemności. Pozwala to na rozwój zarodka do stadium larwalnego 25, które jest optymalnym stadium infekcji w dniu zakażenia.

Przenieś zarodki za pomocą pipety transferowej w 60 mililitrach wody jajecznej na bardzo głęboką szalkę Petriego. Następnie użytkownik mikroskop preparacyjny i pęseta Dumont w celu usunięcia powłoki zarodków. Można to osiągnąć, delikatnie rozrywając Corian jak paczkę chipsów ziemniaczanych, aż ryba wyskoczy.

Gdy wszystkie zarodki zostaną pokryte powłoką. Tak więc, podczas gdy szalka Petriego, aby przesunąć rybę w kierunku środka, przenieś rybę na pokrywkę naczynia, usuń podłoże i zastąp świeżą wodą z jajka. Dodaj rybę do świeżej wody z jaj.

Przygotować 200 mikrogramów na mililitr roztworu sulfonianu trikametanu w celu znieczulenia ryb za pomocą pipety transferowej. Zbierz od 20 do 50 zarodków i umieść je w roztworze znieczulającym na jedną do dwóch minut lub do momentu, gdy przestaną się poruszać. W międzyczasie włącz jednostkę wtryskową, upewniając się, że ciśnienie przełącza się na impuls, a czas trwania impulsu jest ustawiony na dziewięć z trzema PSI dla jednostki przeciwciśnieniowej.

Stopniowo otwieraj zawór na zbiorniku azotu, aż ciśnienie wtrysku osiągnie 30 PSI. Następnie załaduj zbiorczą mikropipetę pięcioma mikrolitrami roztworu Vortex Candida Albican i umieść ją w uchwycie na mikropipety. Umieścić bardzo głęboką szalkę Petriego zawierającą wodę na stoliku mikroskopu preparacyjnego i wyregulować położenie mikropipet tak, aby była widoczna, a jej końcówka była tylko częściowo zanurzona w wodzie.

Następnie za pomocą pęsety przytnij igłę połączonej pipety około trzech milimetrów od końcówki. Jeśli igła została pomyślnie przecięta, naciśnięcie przełącznika nożnego jednostki iniekcyjnej powinno umożliwić dozowanie płynu. Za pomocą szkiełka z podziałką zmierz dozowaną objętość, a następnie wyreguluj ciśnienie tak, aby objętość dozowanego płynu miała średnicę 0,21 milimetra lub była nieco mniejsza od wielkości źrenicy zarodka danio pręgowanego.

Po ustawieniu mikroskopu i znieczuleniu ryb należy spęcznieć naczynie, aby przyciągnąć rybę do środka i umieścić ją w pipecie transferowej. Ostrożnie postukaj w bok pipety, aby ryba osiadła na końcówce. Następnie, używając jak najmniejszej objętości, delikatnie umieść rybę na naczyniu do wstrzykiwań larw aose podgrzanym do 28 stopni Celsjusza.

Za pomocą gładkiego szklanego pręta ostrożnie wyrównaj rybę. Następnie ręcznikiem papierowym usuń jak najwięcej płynu z naczynia. Umieść naczynie aros z rybami pod mikroskopem, aż zarówno igła, jak i pierwsza ryba będą dobrze widoczne.

Upewnij się, że każda ryba jest nadal żywa, obserwując obecność widocznego bicia serca. Jeśli jest martwy, wyrzuć go i przejdź do następnego. Przesuń szklaną igłę w kierunku ryby, która się przybliża.

Robiąc to, ostrożnie włóż igłę w okrągłą strukturę ucha ryby z dwoma kamieniami usznymi znajdującymi się tuż za okiem. Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, wstrzyknąć drożdże za pomocą przełącznika nożnego. Jeśli igła zostanie prawidłowo włożona, ryba jest tylna komora mózgu lekko zasunie się po wstrzyknięciu, wycofaj igłę i powtórz procedurę z następną rybą.

Cały proces nie powinien trwać dłużej niż 15 lub 20 minut, w przeciwnym razie ryba wyschnie i umrze po tym czasie. Drożdże osadzają się również na dnie mikropipety i prowadzą do nierównomiernego zakażenia, dawek i/lub zatkania połączonej mikropipety. Gdy wszystkie ryby zostaną wstrzyknięte, użyj wody z jaj, aby zmyć je z aros i umieścić na świeżej szalce Petriego zawierającej 60 mililitrów wody jajecznej.

Następnie nastawiamy naczynie w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Zamknij zawór azotu, ustaw przełącznik wtrysku w pozycji ciągłej, aby zmniejszyć ciśnienie w przewodzie zbiornika. Następnie, gdy ciśnienie spadnie do zera, ustaw przełącznik z powrotem na puls i wyłącz jednostkę wtryskową.

Rozpocznij od znieczulenia zakażonych ryb siarczanem trikametanu, jak opisano wcześniej. Gdy ryby zostaną znieczulone, za pomocą pipety przenieś jedną rybę na raz do szalki Petriego zawierającej 0,4% agar o niskiej temperaturze topnienia. Następnie za pomocą pipety transferowej i przenosząc jak najmniej agros.

Przenieś każdą rybę z szalki Petriego do jednej studzienki naczynia do obrazowania ze szklanym dnem o temperaturze około 0,2 mililitra i 0,4%Powstało nisko topione uzupełnienie 200 mikrogramów na mililitr środka znieczulającego na wierzchu ryby, tak aby wewnętrzne kręgi zostały wypełnione, a cienka warstwa aros rozprzestrzeniła się po dnie studzienki. Ryby można teraz obrazować przez okres do 24 godzin za pomocą odwróconego mikroskopu z laserowym skaningowym systemem konfokalnym. Pięć godzin po zakażeniu danio pręgowanego czerwoną fluorescencyjną Candida albicans.

Drożdże są widoczne w tylnej części mózgu ryby u ryb FL I jeden EGFP, takich jak te, śródbłonek naczyniowy i komórki podobne do makrofagów w całym ciele ryby są fluorescencyjne. Są pokazane tutaj na zielono, pięć godzin po zakażeniu. Drożdże można zobaczyć w komórkach podobnych do makrofagów przez 24 godziny.

Infekcja rozprzestrzeniła się wzdłuż tkanki ogona grzbietowego, gdzie drożdże można ponownie wykryć w komórkach FTIC. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzykiwać mikro Candida albicans do tylnej komory mózgowia danio pręgowanego w stadium Prim 25, w tym jednego przygotowującego kulturę grzybów, dwóch znieczulających larw danio pręgowanego. Trzy mikrowstrzyknięcia do komory tyłomózgowia.

I cztery, przygotowanie zakażonych larw do obrazowania konfokalnego.